壁虎醇提物對人食管癌細胞EC9706增殖及凋亡蛋白表達的影響

1/1壁虎醇提物對人食管癌細胞EC9706增殖及凋亡蛋白表達的影響壁虎醇提物對人食管癌細胞EC9706增殖及凋亡蛋白表達的影響作者：

王曉蘭王建剛宋佳玉李瑞芳【摘要】目的研究壁虎醇提物對人食管鱗癌細胞株EC9706的生長抑制作用及其機制。

方法通過MTT法檢測不同濃度、不同時間壁虎醇提物對人食管鱗癌細胞的生長抑制作用;倒置顯微鏡觀察不同濃度壁虎醇提物作用細胞24h后細胞形態(tài)的改變;吉姆薩染色后光學顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)改變;SP免疫組化法檢測細胞內(nèi)凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達。

結(jié)果6～8mg/ml壁虎醇提物作用于細胞24，48，72h后能夠明顯抑制EC9706食管鱗癌細胞株的生長(Plt;0.01,與陰性對照比較)，抑制率分別為13%～76%,37%～88%,54%～93%,抑制作用呈劑量和時間依賴性;Geimsa染色可見凋亡細胞;免疫組化結(jié)果顯示,壁虎醇提物(6,7mg/ml)處理細胞24h后，與陰性對照組比較，細胞內(nèi)Bcl-2蛋白無明顯變化，而Bax蛋白表達升高，Bax/Bcl-2比值升高。

結(jié)論壁虎醇提物能夠抑制EC9706細胞的增殖并誘導其凋亡，其作用機制可能與凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值升高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】中藥壁虎;醇提物;食管癌細胞;凋亡蛋白壁虎又名蝎虎、天龍、守宮，是我國傳統(tǒng)的治療腫瘤的中藥材，《四川中藥志》關(guān)于壁虎的功效有驅(qū)風，破血積包快，治腫瘤的記錄，大量臨床和基礎(chǔ)研究顯示壁虎確有抗腫瘤作用[1,2]。

我們前期工作研究表明干壁虎粉可以抑制食管癌細胞的生長增殖，抑制小鼠S180肉瘤的增殖，初步探討其抗腫瘤作用機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡，下調(diào)VEGF、bFGF蛋白表達有關(guān)[3～5]。

本實驗研究了干壁虎的醇提物對人食管鱗癌EC9706細胞的增殖和凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達的影響，為中藥壁虎抗腫瘤作用提供實驗依據(jù)。

1器材1.1藥品中藥壁虎(安徽省亳州市永剛飲片有限公司)，批號：

090301。

1.2細胞EC9706食管癌細胞株，由鄭州大學醫(yī)學院王立東教授實驗室惠贈。

1.3試劑絲裂霉素C(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：

H33020786);胎牛血清(Gibco公司);胰酶(Sigma公司);RPMI-1640干粉(Gibco公司);MTT粉劑(Sigma公司);二甲基亞砜(天津市化學制劑廠);鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)公司)。

1.4儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);倒置顯微鏡XSZ-D2型(重慶光學儀器廠);超凈工作臺SP-DJ-2B型(浙江省金沄市榮華儀器制造有限公司);ZS-板式酶標儀(中科院生物物理所制造);86-3型超聲儀(上海超聲波儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司);冷凍干燥儀(德國MARTINCHRIST公司);96、6孔培養(yǎng)板為美國Costar公司產(chǎn)品。

2方法2.1藥物提取及配制2.1.1壁虎醇提物的提取取干壁虎1000g粉碎，加入一定體積預冷的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)浸泡過夜后超聲30min，超低溫離心機離心(8500r/min,20min)，取上清，加入無水乙醇使其終濃度為55%,4℃放置并攪拌(每30分鐘攪拌1次)，4h后離心(8500r/min,20min)，取上清，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(55℃)回收乙醇，濃縮液冷凍干燥得到壁虎醇提物，-20℃保存待用。

以上操作均4℃條件下進行。

2.1.2藥物配制將壁虎醇提物以RPMI1640完全培養(yǎng)液配置8mg/ml母液，0.22m微孔濾膜過濾,母液稀釋得7.5，7，6.5，6，5.5mg/ml供實驗用,以上藥物均實驗前新鮮配用。

2.2MTT法[6]測定藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用EC9706細胞株生長于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液中,37℃恒溫,5%CO2，95%飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中生長。

取對數(shù)生長期的EC9706細胞，用0.25%胰酶消化細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100l，實驗分3組，即實驗組、陰性對照組、陽性對照組，每組設(shè)5個復孔并設(shè)空白調(diào)零孔。

將接種EC9706細胞的培養(yǎng)板置于37℃,5%CO2,95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去原有的培養(yǎng)液,實驗組分別加入各200l的6種不同濃度壁虎醇提物,陰性對照組加200l培養(yǎng)液,陽性對照孔組加終濃度為20g/ml絲裂霉素C200l,混勻后置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24,48,72h后取出培養(yǎng)板，每孔加入20l濃度為5mg/ml的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h終止培養(yǎng),吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入二甲基亞砜150l,置37℃搖床中10min,使結(jié)晶物充分溶解后在酶聯(lián)檢測儀于490nm波長處測定各孔光密度值(OD值),并按下式計算抑制食管癌細胞的百分率。

抑制率(%)=[(陰性對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/陰性對照組平均OD值]100%2.3細胞形態(tài)學觀察96孔板細胞接種方法同MTT法，分別加入5.5，6，6.5，7，7.5，8mg/ml濃度壁虎醇提物作用24h后，取出96孔板在倒置顯微鏡觀察每孔細胞形態(tài)改變，拍照。

細胞爬片后，按常規(guī)方法用吉姆薩染色，于光學顯微鏡鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學改變。

2.4S-P法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達水平取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液后，以1105個/ml的細胞濃度接種于內(nèi)含有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，24h細胞貼壁后換用新鮮培養(yǎng)液，實驗設(shè)對照組和藥物組，實驗組加入6，7mg/ml壁虎醇提物2ml，陽性組加入2ml絲裂霉素C,使其終濃度為20g/ml,陰性對照組加入同體積的RPMI1640培養(yǎng)液，24h后取出6孔板，細胞爬片用PBS浸洗，4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS浸洗;0.3%Trixon-100通透液通透30min,PBS浸洗;每張爬片滴加1滴3%過氧化氫，孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS浸洗;每張爬片滴加1滴封閉用非免疫性動物血清，室溫下孵育10min，吸去多余液體;每張爬片滴加1滴鼠抗人Bcl-2一抗，37℃孵育1h，PBS浸洗;每張爬片滴加1滴生物素標記的二抗，37℃孵育10min.PBS浸洗;每爬切片滴加1滴鏈親和素一過氧化物酶溶液，37℃孵育10min，PBS浸洗;每張爬片滴加100l新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下掌握顯色程度，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

用同樣方法檢測Bax蛋白表達。

以PBS代替一抗作為陰性對照，同時設(shè)立陽性對照。

Bcl-2陽性表達在胞漿或胞膜，Bax陽性表達在胞漿。

每張爬片隨機選取6個不同部位，顯微鏡下拍照，應用成都泰盟BI-2000生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對免疫組化陽性細胞進行分析，測定陽性細胞的平均光密度值。

2.5統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，計量資料結(jié)果以s表示,Plt;0.05表示差異有顯著性。

3結(jié)果3.1MTT法檢測結(jié)果5.5，6，6.5，7，7.5，8mg/ml壁虎醇提物作用24h對EC9706細胞的抑制率分別為8%，13%，23%，40%，68%，76%;作用48h后對EC9706細胞的抑瘤率分別為28%，37%，56%，77%，86%，88%;繼續(xù)作用至72h后，壁虎醇提物對腫瘤生長的抑制作用更為明顯，與陰性對照組比較，壁虎醇提物能夠顯著抑制了EC9706細胞的生長(Plt;0.01)，其抑制作用隨時間、濃度的增加而不斷加強，呈一定劑量依賴性和時間依賴性(見表1，圖1～2)。

24，48，72h壁虎醇提物的IC50值分別為7.14，6.20，5.80mg/ml。

表1不同濃度壁虎醇提物對EC9706食管癌細胞的增殖抑制作用3.2細胞形態(tài)學觀察5.5～8mg/ml壁虎醇提物處理細胞24h后，倒置顯微鏡下觀察，陰性對照組細胞大小均一呈上皮型貼壁生長，相互連接成片，細胞多呈梭形，形狀規(guī)則，生長旺盛。

壁虎醇提物組細胞胞漿發(fā)生空泡變性，細胞數(shù)量明顯減少,貼壁細胞變小、變圓并浮起，形態(tài)完整性受破壞,形成大量細胞碎片,上述細胞改變隨藥物濃度增加，表現(xiàn)越明顯。

Geimsa染色顯示,陰性對照組細胞胞漿染色較淺呈淡藍色，胞核染成紫紅色，細胞胞漿少，核漿比例大，核膜表面光滑，形態(tài)大小均一，核仁清晰可見;7mg/ml壁虎醇提物處理細胞24h后，部分細胞呈凋亡形態(tài)改變，細胞體積縮小，核膜表面不光滑、皺縮，形態(tài)不規(guī)則;染色質(zhì)固縮，核深染。

3.3免疫組化檢測凋亡蛋白的表達免疫組化結(jié)果顯示，與正常對照組相比，壁虎醇提物和絲裂霉素C處理EC9706細胞24h后，Bax蛋白表達顯著增加(Plt;0.01),而Bcl-2的表達無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)，Bax/Bcl-2的比值增加。

結(jié)果見表2，圖3～4。

表2壁虎醇提物對EC9706細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響4討論壁虎雖未被載入《中國藥典》，但大量的臨床報道證明，壁虎對消化道腫瘤治療有獨特的療效，且毒副作用小[1]。

盡管壁虎抗腫瘤作用明確，但其成分十分復雜、作用機制不清楚、臨床適應證不明確。

目前對壁虎抗腫瘤的活性成分研究較少，本課題研究了壁虎醇提物對人食管鱗癌細胞EC9706增殖抑制作用，結(jié)果表明壁虎醇提取物在5.5～8mg/ml劑量下體外以劑量和時間依賴性的方式抑制人食管癌細胞株EC9706增殖。

光鏡下可見細胞隨著藥物濃度增加，細胞數(shù)目逐漸減少，細胞體積逐漸變小變圓，直至細胞碎裂。

Giemsa染色可見凋亡細胞體積縮小，細胞核表面不光滑、皺縮，形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)固縮，核深染。

細胞凋亡是一種非常復雜的生理和病理過程，是受控于基因指導的主動性細胞自我消亡過程，是細胞固有的功能。

其形態(tài)特征包括細胞固縮、染色質(zhì)聚集、邊集至核膜下及凋亡小體形成[7]。

現(xiàn)在普遍認為，無論藥物的靶點何在，多種化療藥物最終主要通過誘導腫瘤細胞凋亡或壞死而達到治療目[8]。

凋亡的線粒體通路主要由Bcl-2家族成員所調(diào)控，該家族可分為兩個亞群：

一個亞群Bcl-2，Bid，Bcl-X，Bcl-W等抗凋亡蛋白組成;另一個亞群由Bax，Bak，Bik，Bcl-xs等促凋亡分子組成[9]。

下調(diào)Bcl-2或上調(diào)Bax可促進多種因素誘導的多種腫瘤細胞凋亡,反之則抑制腫瘤細胞凋亡[10]，Bcl-2蛋白與Bax蛋白的比值直接影響著細胞受到刺激后發(fā)生凋亡的比率，兩者的平衡是決定細胞死亡和存活的重要因素。

因此，Bax，Bcl-2蛋白表達比例具有重要的生理意義。

本研究結(jié)果表明壁虎醇提取物能夠誘導人食管癌細胞株EC9706凋亡，增強Bax的蛋白表達、通過升高Bax/Bcl-2比值而實現(xiàn)對EC9706細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。

綜上所述，壁虎醇提取物對人食管癌EC9706細胞株增殖有抑制作用，藥物作用效果具有較明顯的時-效和量-效關(guān)系，其抑制作用可能通過上調(diào)Bax的表達，通過改變Bax/Bcl-2的比值而誘導細胞凋亡。

本實驗中所用的醇提取物乃是一種混合物，其抑制腫瘤作用主要由一種成分起作用還是由多種成分協(xié)同起作用，有待進一步研究。

【參考文獻】[1]楊金霞,王學美.壁虎治療腫瘤的研究進展[J].世界華人消化雜志,2006,14(4):2428.[2]張飛春,李中信,杜文平.守宮抗腫瘤研究進展[J].河北中醫(yī),2009，31(1)：

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