胞內(nèi)S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和 ER-α表達的關(guān)系

1/1胞內(nèi)S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和ER-α表達的關(guān)系胞內(nèi)S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和ER-表達的關(guān)系【摘要】目的探討S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）升高抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和雌激素受體-（estrogenreceptor-，ER-）基因表達變化的關(guān)系。

方法以分離的原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）為研究對象，經(jīng)不同濃度的SAH水解酶強效抑制劑3-deazaadenosine（DZA）處理24～72h后，反相高效液相色譜法測定胞內(nèi)SAH濃度，利用細胞計數(shù)法、流式細胞儀和TUNEL技術(shù)檢測細胞的增殖凋亡能力，Westernblot法檢測ER-蛋白的表達，熒光定量-PCR檢測其mRNA表達，甲基化特異PCR法檢測ER-基因啟動子甲基化狀態(tài)。

結(jié)果經(jīng)DZA處理后，HUVEC胞內(nèi)SAH濃度升高（P＜0.05），生長增殖能力降低（主要受阻于G1/G0期），凋亡率增加（P＜0.05），ER-mRNA和蛋白的相對表達量降低（P＜0.05），但DZA處理前后ER-基因啟動子甲基化狀態(tài)不發(fā)生明顯改變。

結(jié)論SAH升高抑制HUVEC的增殖能力與ER-的表達變化有關(guān)，但這種作用不是通過改變ER-基因啟動子的甲基化而實現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】S-腺苷同型半胱氨酸人臍靜脈內(nèi)皮細胞雌激素受體-甲基化Abstract：

ObjectiveToexploretherelationshipofinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularS-adenosylhomocysteine(SAH)accumulationandexpressionofestrogenreceptor-(ER-)inHUVEC.MethodsAfterisolatedprimaryHUVECtreatedwithout(normal)orwith3-deazaadenosine(DZA),apotentS-adenosylhomocysteinehydrolaseinhibitor,for24-72h,intracellularSAHlevelwasmeasuredwithreversedphasehigh-performanceliquidchromatography(RP-HPLC).TheproliferativeabilityofHUVECwasdetectedwithcytometry,flowcytometryandTUNELmethods.TheexpressionofER-proteinandmRNAwasdeterminedwithWesternblotandquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(qRT-PCR)techniques,respectively.ThepromotermethylationofER-genewasanalyzedwithmethylationspecificPCR(MSP).ResultsTheresultsshowedthatthelevelofintracellularSAHwasincreasedinHUVECincubatedwithDZAcomparedtonormal.TheproliferativeabilityofHUVECweredecreasedandtheapoptoticratewasincreasedaftertreatmentwithDZA(P＜0.05).TherelativeexpressionofER-mRNAandproteininHUVECtreatedwithDZAwaslowerthanthatofnormal(P＜0.05).ButtherewerenoobviouschangesofER-genepromotermethylationinHUVECbeforeandaftertreatmentwithDZA.ConclusionsThesefindingssuggestedthattheinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularincreasedSAHwascorrelativewithER-expressioninHUVEC.Thisactionwasnotrelatedwithitspromotermethylatedpatterns.Keywords:S-adenosylhomocysteine;humanumbilicalveinendothelialcells;estrogenreceptor-;methylation隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）與血管疾病間并不一定存在著必然的因果關(guān)系，蛋氨酸的另一中間代謝產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）可能是血管疾病的真正致病因素，而Hcy可能只是其中的一個伴隨現(xiàn)象［1］。

近年來人們研究證實，動脈粥樣硬化（artherosclerosis，As）相關(guān)基因啟動子甲基化的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失調(diào)在As形成過程中拌演著重要的角色［2］。

我們先前研究發(fā)現(xiàn)3-deazaadenosine（DZA）作為S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的強效抑制劑，其應(yīng)用在降低Hcy的同時，可以升高胞內(nèi)SAH含量，降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的表達，導(dǎo)致整體基因組低甲基化［3］。

為了進一步闡明SAH升高促進As形成的機制，本研究探討了DZA對HUVEC增殖的影響與ER-基因表達變化及其啟動子甲基化的關(guān)系。

1材料和方法1.1主要試劑1640培養(yǎng)基干粉購于Hyclone公司；特級胎牛血清、DeathDetectionKit(POD原位細胞凋亡檢測試劑盒)購于醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院生物工程研究所；SAH標準品和DZA購自Sigma公司；CytotoxicityDetectionKit購自(RocheMolecularBiochemicals公司；CycleTESTTMPLUSDNA試劑盒購自BDBiosciencesPharmingen公司；UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（CatDV811A）購自寶生物工程（大連）有限公司；GENMED蛋白質(zhì)西方雜交印跡試劑盒（Cat.GMS30005.2）購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；EZDNAMethylation-GoldKit(tm)試劑盒（Cat.D5005）購自ZYMORESEARCHCORP公司。

1.2細胞來源及分組取足月妊娠分娩后的新生兒臍帶20cm，1.25g/L胰蛋白酶消化分離內(nèi)皮細胞，1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，5％CO2，37℃常規(guī)培養(yǎng)傳代［4］。

考慮SAH不能直接通過哺乳動物的細胞膜，應(yīng)用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑DZA阻斷SAH向Hcy的轉(zhuǎn)化，從而升高胞內(nèi)SAH的濃度。

實驗分為以下4組：

①對照組；②5mol/LDZA處理組；③10mol/LDZA處理組；④20mol/LDZA處理組。

處理時間分別為24、48、72h，對照組用等體積的滅菌雙蒸水代替DZA。

經(jīng)CytotoxicityDetectionKit檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放量完全排除了DZA的細胞毒性作用。

1.3反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定SAH濃度提取胞漿蛋白，Bradford法測蛋白含量后，按1∶1體積比加入等量三氯乙酸（100g/L，含4mmol/LEDTA2K)，漩渦振蕩混勻，4℃13000r/min離心10min。

取20l上清液上機分析胞漿SAH的濃度（nmol/mgprotein）。

檢測條件：

美國Waters公司高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，Waters1525BinaryHPLCpump高壓泵，7125i進樣器，Waters2966photodiodearraydetector紫外檢測器；大連依利特HypersilBDSC18(4.6mm250mm，5m)色譜柱；柱溫40℃；檢測波長260nm；流動相50mmol/LNaH2PO4(pH=5.5)∶甲醇=9.5∶0.5,流速0.8ml/min；進樣量20l。

1.4細胞生長曲線繪制以5104個/ml密度接種HUVEC細胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔2ml，分別加不同濃度的DZA干預(yù)培養(yǎng)1～4d，每天各取3孔，臺盼藍染色，顯微鏡下計數(shù)非染色的活細胞數(shù)，繪制生長曲線，并按如下公式計算細胞生長抑制率（GI）=（Nc-Nt）/Nc100%，其中Nc和Nt分別為某一時相點對照組和處理組細胞數(shù)。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期相分布按照BDBiosciencesPharmingen公司提供的CycleTESTTMPLUSDNA試劑盒說明書進行。

細胞經(jīng)處理后送至中山大學(xué)免疫教研室用BDFACScan流式儀（Macintosh操作平臺，BDCellQuest1.0分析軟件）分析細胞周期相分布。

1.6TUNEL檢測細胞凋亡按照DeathDetectionKit,POD原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。

主要步驟：

4%多聚甲醛溶液室溫固定HUVEC30min，PBS洗片，與阻斷劑（0.3%H2O2甲醇溶液）室溫孵育30min，PBS洗片，加通透液（0.1%TritonTMX-100溶于0.1%枸鞣酸鈉溶液）在冰浴中孵育2min，PBS沖洗2次，滴加50l的TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60min，PBS沖洗3次，在熒光鏡下分析結(jié)果并照相。

1.7Westernblot法檢測ER-蛋白的表達按照GENMED蛋白質(zhì)西方雜交印跡試劑盒說明書進行。

提取胞漿蛋白，Bradford法測蛋白含量后，取40g總蛋白進行SDS凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏(二)氟乙烯膜（PVDF），1%BSA的PBST（含5%tween-20的PBS緩沖液）封閉1h，1∶400稀釋ER-單抗4℃過夜，PBST漂洗10min3，1∶40稀釋生物素化二抗工作液，室溫振搖1h，PBST漂洗10min3，1∶40稀釋HRP標記的鏈酶卵白素三抗工作液，室溫振搖1h，PBST漂洗10min3，DAB顯色，照相并進行圖象分析計算ER-蛋白的相對表達量（正常組設(shè)為100）。

1.8qRT-PCR法檢測ER-mRNA的表達HUVEC細胞經(jīng)處理后送至中山大學(xué)達安基因有限公司檢測ER-mRNA的表達量。

用TRIZol提取總RNA，取4lRNA模板做逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

內(nèi)參-actin采用RT-PCR熒光定量，ER-采用巢式RT-PCR熒光定量。

-actin引物：

Forward5-GCGCGGCTACAGCTTCA-3，Reverse5-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3，探針序列5-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3；ER-外引物：

Forward5-TGCCAGGCTTTGTGGATTTG-3，Reverse5-GCCGCTGCATGACCTCCT-3，內(nèi)引物：

Forward5-TCTCGTCTGGCGCTCCAT-3，Reverse5-CTGGTTCCTGTCCAAGAGCAA-3，探針序列5-FAM-CACCCAGGGAAGCTACTGTTTGCTCCTAA-TAMRA-3。

所有引物由上海生工合成。

ER-mRNA的相對表達量為ER-拷貝數(shù)與-actin的拷貝數(shù)之比。

1.9MSP法檢測ER-基因啟動子甲基化按照UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（Cat.DV811A）說明書提取DNA，按照EZDNAMethylation-GoldKit(tm)試劑盒（CatalogNos.D5005）說明書步驟對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。

通過http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer設(shè)計ER-甲基化（M）和非甲基化（U）引物，由上海生工合成，其中甲基化引物：

Forward5-GAACGAGTTGGAGTTTTTGAATC-3，Reverse5-CCGATCTAACCGTAAACCTACG-3，擴增片段171bp；非甲基化引物：

Forward5-GAATGAGTTGGAGTTTTTGAATTGT-3，Reverse5-AAAAACCAATCTAACCATAAACCTACA-3，擴增片段176bp。

該引物對應(yīng)序列位于ER-基因啟動子的第二CpG島（457bp-843bp）。

擴增條件：

94℃5min，94℃30s，59.5℃30s，70℃30s，40循環(huán)，最后70℃延伸10min。

擴增產(chǎn)物2%凝膠電泳30min觀察并照相。

1.10數(shù)據(jù)處理用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用s表示，采用Studentsｔ檢驗獨立樣本的差異性，least-squares法進行相關(guān)性分析，檢驗的顯著性水平設(shè)在Ｐ＜0.05.2結(jié)果2.1胞內(nèi)SAH濃度（圖1）對照組細胞內(nèi)SAH的濃度為4.320.65nmol/mgprotein，培養(yǎng)24,48,72h后，其含量處于一個相對穩(wěn)定水平。

但經(jīng)DZA處理后，胞內(nèi)SAH的濃度顯著升高（Ｐ＜0.05），DZA的作用濃度越高、作用時間越長，胞內(nèi)SAH含量增加越明顯，提示DZA對胞內(nèi)SAH濃度的增加效應(yīng)具有時間和劑量依賴性。

2.2HUVEC細胞生長增殖能力（圖2）從HUVEC細胞的生長曲線反應(yīng)DZA對血管內(nèi)皮細胞生長增殖能力的影響。

按公式計算結(jié)果顯示DZA處理24～96h對HUVEC細胞的生長抑制率為24.1%～69.6%，相關(guān)性分析顯示SAH濃度與細胞數(shù)存在負相關(guān)（r=-0.89,Ｐ＜0.001），提示胞內(nèi)SAH升高能抑制HUVEC細胞生長增殖。

2.3細胞周期相分布經(jīng)三種不同濃度的DZA分別處理24,48,72h后，細胞周期相的百分比分布發(fā)生不同的變化，其中G1/G0期隨著DZA濃度的增加和作用時間的延長，由正常對照的53.4612.35%上升至58.2113.24%～86.2013.57%，S期由正常對照的35.198.96%下降至33.188.55%～8.102.46%，而G2/M期的變化無規(guī)律，提示胞內(nèi)SAH升高主要使HUVEC細胞周期受阻于G1/G0期（Ｐ＜0.05），而S期減少（Ｐ＜0.05）。

2.4HUVEC細胞凋亡結(jié)果（圖3）利用TUNEL法檢測細胞凋亡時，在熒光顯微鏡下觀察到凋亡的細胞呈陽性。

本實驗中對照組可見少量熒光染色呈陽性的凋亡細胞，20mol/LDZA處理24,48,72h后，熒光染色的強度逐漸增加，特別是作用72h后熒光強度最強，提示胞內(nèi)SAH升高能使HUVEC血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生凋亡。

2.5ER-蛋白表達（圖4）Westernblot法檢測ER-蛋白的表達結(jié)果以PVFD膜上染色條帶的深淺來判斷蛋白表達的高低。

實驗結(jié)果顯示，對照組染色條帶最深，5,10,20mol/LDZA處理24h后，染色條帶強度逐漸減弱（圖4A），圖片分析結(jié)果顯示ER-蛋白的相對表達量（對照組設(shè)定為100%）隨著DZA濃度的增加而降低（Ｐ＜0.01，圖4B），SAH濃度與ER-蛋白的相對表達量存在負相關(guān)（r=-0.92,Ｐ＜0.001），提示胞內(nèi)SAH升高能抑制促增殖基因ER-蛋白的表達。

2.6ER-mRNA表達（圖5）不同濃度的DZA處理72h后，與對照組相比，HUVEC細胞ER-mRNA的表達量顯著降低，隨著DZA濃度的增加，其表達量下降越明顯（Ｐ＜0.05），SAH濃度與ER-mRNA的表達量間也存在負相關(guān)（r=-0.88,Ｐ＜0.001），提示胞內(nèi)SAH的升高能抑制ER-mRNA的表達。

圖5熒光定量PCR檢測ER-mRNA表達（n=3）2.7ER-基因啟動子甲基化（圖6）甲基化特異的PCR（MSP）引物有兩對：

一對是針對基因啟動子CpG島未甲基化序列的引物（U），另一對是針對基因啟動子CpG島發(fā)生甲基化序列的引物（M），因而兩對引物中只有一對引物（U或M）能擴增，其MSP產(chǎn)物電泳結(jié)果只有一個亮帶。

對照組HUVEC細胞ER-基因啟動子第二CpG島U引物未見擴增產(chǎn)物（176bp），而M引物的擴增產(chǎn)物在171bp處有一亮帶，表明ER-基因啟動子第二CpG島處于甲基化狀態(tài)，經(jīng)5,10,20mol/LDZA處理72h后，其甲基化狀態(tài)仍未發(fā)生改變，提示DZA并不能改變ER-基因啟動子第二CpG島甲基化狀態(tài)。

3討論血管內(nèi)皮細胞損傷是As發(fā)生的早期病理特征。

以往有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞功能的損傷，并不總是隨著循環(huán)系統(tǒng)中總同型半胱氨酸濃度的增加而增加［2，5］。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用DZA升高了胞內(nèi)SAH含量，細胞的生長增殖能力下降24.1%～69.6%（主要受阻于G1/G0期），同時凋亡率增加，SAH濃度與細胞數(shù)存在負相關(guān)（r=-0.89,Ｐ＜0.001），從而提示SAH升高能抑制血管內(nèi)皮細胞的生長，SAH在As的形成過程中發(fā)揮著重要的作用。

有關(guān)表遺傳學(xué)中特異基因啟動子甲基化導(dǎo)致其表達變化在腫瘤中報道較多，但在As中目前只有對ER-、ec-sod及p53等少數(shù)幾個基因的研究［6］，胞內(nèi)SAH的升高抑制血管內(nèi)皮細胞增殖是否與增殖基因ER-啟動子的甲基化而導(dǎo)致其表達有關(guān)，未見報道。

雌激素受體（ER）屬于核受體家族，有ER-和ER-兩個亞型。

在心血管疾病中對ER-的研究較多，而對ER-的研究較少［7］。

KortelainenML等［8］用ER的單克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前的女性中患有明顯As者其表達降低，提示ER基因表達沉默與As形成有明顯的相關(guān)性。

近年來對已患有冠心病女性的隨機研究表明雌激素替代療法（HRT）對絕經(jīng)后女性沒有益處，且這種效應(yīng)與脂質(zhì)變化無關(guān)，提示可能有其他機制參與。

為了探討該機制，PostWS等［9］采用Southernblot方法研究表明在右心房中年齡相關(guān)ER-基因甲基化增加，在靜脈和動脈中能檢測到ER-表達，在As斑塊中比正常鄰近動脈ER-基因甲基化明顯增加，而在體外培養(yǎng)人動脈內(nèi)皮細胞ER-基因甲基化卻保持較低。

另外，在培養(yǎng)動脈平滑肌細胞（SMC）與As斑塊中的SMC有相似的表型，ER-基因甲基化水平較高（19%～99%），從而提示血管組織中ER-基因甲基化致其表達失活在As形成和血管系統(tǒng)老化中發(fā)揮重要作用［10］。

另有研究也發(fā)現(xiàn)ER-基因甲基化與老齡化As呈明顯相關(guān)性（r=0.36，Ｐ＜0.05）［9］。

然而，本實驗結(jié)果顯示，對照組HUVEC細胞ER-基因處于甲基化狀態(tài)，其mRNA的表達量相對內(nèi)參-actin來說較低，胞內(nèi)SAH升高對ER-基因的甲基化狀態(tài)沒有明顯的改變，但在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平降低了ER-表達（r=-0.92,-0.88,Ｐ＜0.001），提示SAH升高對ER-的調(diào)節(jié)作用不是通過改變啟動子甲基化實現(xiàn)的，是通過何種途徑還有待進一步的探討。

【參考文獻】［1］FruchartJC,NiermanMC,StroesES,etal.NewRiskFactorsforAtherosclerosisandPatientRiskAssessment［J］.Circulation,2004,109(23Suppl1):15-19.［2］BrattstromL,WilckenDE.HomocysteineandCardiovascularDisease:CauseorEffect?［J］.AmJC