高表達(dá)UBE2B在食管癌中的臨床意義及其與免疫浸潤相關(guān)性

食管癌是常見的胸部惡性腫瘤,包括食管鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。對可切除的食管癌病變,主要采用手術(shù)治療[1],但僅靠手術(shù)切除并不能達(dá)到滿意的療效。數(shù)據(jù)顯示,患者手術(shù)治療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率較高,手術(shù)后近5年的生存率僅為30%左右[2]。隨著腫瘤免疫學(xué)研究的深入,免疫治療已成為降低食管癌患者總體死亡率的有效手段。免疫治療表現(xiàn)出特異性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點,其可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)能力,起到消除腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移的作用[3],尋找食管癌的免疫治療靶點對于提高治療效果和增加生存率有重要意義。組蛋白泛素化在調(diào)節(jié)DNA修復(fù)系統(tǒng)之間的相互作用中起著重要作用。UBE2B是泛素結(jié)合酶,參與RAD18介導(dǎo)的H2B和增殖細(xì)胞核抗原(PNCA)的泛素化,通過激活DNA聚合酶的DNA損傷耐受性繞過DNA復(fù)制介導(dǎo)的單鏈斷裂[4]。研究表明,UBE2B與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。比如,UBE2B通過促進(jìn)RAD18介導(dǎo)的ZMYM2單泛素化和穩(wěn)定化促進(jìn)食管癌生長[5]。在結(jié)直腸癌中,UBE2B的過度表達(dá)與術(shù)前患者的不良反應(yīng)和低生存率有關(guān)[6]。UBE2B缺失通過抑制WNT/β-Catenin信號來破壞黑色素瘤表型的表達(dá)[7]。在三陰性乳腺癌中,UBE2B通過影響DNA跨損傷合成(translesionsynthesis)介導(dǎo)順鉑耐藥[8]。但是關(guān)于UBE2B與食管癌的研究尚未明確。因此,本文運用生物信息學(xué)的方法,分析UBE2B對食管癌的作用,為食管癌治療靶點的挖掘提供參考。1材料與方法1.1UBE2B在食管癌中的表達(dá)分析利用UALCAN(/index.html)工具中的TCGAGeneanalysis功能分析UBE2B在TCGA食管癌樣本中的表達(dá)情況,UBE2B的表達(dá)量以TPM(transcriptpermillion)表示。1.2UBE2B表達(dá)量與食管癌患者預(yù)后相關(guān)性分析通過PrognoScan(http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html)分析GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE11595數(shù)據(jù)集高表達(dá)或低表達(dá)UBE2B與食管癌總體生存率相關(guān)性分析。利用GEPIA(/)分析工具UBE2B的表達(dá)量與TCGA樣本中所有食管癌患者的總體生存率(OS)相關(guān)性。再通過Kaplan-MeierPlotter(/analysis)進(jìn)行高表達(dá)或低表達(dá)UBE2B與食管腺癌或者鱗癌患者OS相關(guān)性分析。1.3UBE2B在放化療食管癌患者中的表達(dá)以及化療敏感性分析食管癌患者術(shù)后放療數(shù)據(jù)來自TCGA,通過cBioPortal(/)下載,利用非配對T檢驗進(jìn)行分析?；熋舾屑澳退帞?shù)據(jù)來自GEO公共數(shù)據(jù)庫(/geo/)中的GSE13525數(shù)據(jù)集,下載提取UBE2B表達(dá)數(shù)據(jù)后進(jìn)行非配對T檢驗分析。運用DepMap平臺分析CCLE細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(/portal/)食管癌細(xì)胞系中UBE2B的基因效應(yīng)(geneeffect)與常用的食管癌化療藥物敏感性的相關(guān)性[9]。1.4UBE2B表達(dá)與食管癌免疫浸潤相關(guān)性分析利用HPA數(shù)據(jù)庫(/)中Immune菜單分析UBE2B在HPAdataset和Monacodataset兩個免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的表達(dá)。利用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析UBE2B表達(dá)與食管癌免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性,通過GEPIA在線工具驗證UBE2B與中性粒細(xì)胞標(biāo)志分子CD66B(CEACAM8)以及CD11B(ITGAM)以及免疫檢查點(checkpoints)PD-1(PDCD1)、PD-L1(CD274)、CTLA4的相關(guān)性。1.5抑制UBE2B的化合物及藥物預(yù)測通過比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(ComparativeToxicogenomicsDatabase,CTDbase;/)預(yù)測抑制UBE2B的表達(dá)或活性的化合物及藥物,然后通過cytoscape(/)進(jìn)行可視化。2結(jié)果2.1UBE2B在食管癌組織中的表達(dá)通過UALCAN工具挖掘TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),UBE2B在食管癌中的表達(dá)顯著高于正常食管組織(P<0.05),見圖1a。而且,亞洲人種的表達(dá)要顯著高于高加索人種(P<0.05),見圖1b,食管癌的2、3、4分期要顯著高于1期的(P<0.05),見圖1c;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(N1、N2、N3)要顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)的(P<0.05),見圖1d。圖1食管癌UBE2BmRNA表達(dá)分析2.2UBE2B與食管癌患者生存預(yù)后相關(guān)性分析prognoscan分析GEO數(shù)據(jù)集GSE11595也顯示,UBE2B高表達(dá)與患者的低總體生存率(OS)顯著相關(guān)(P<0.05),見圖2a。通過GEPIA分析TCGA食管癌患者數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),UBE2B高表達(dá)與患者的低總體生存率顯著相關(guān)(P<0.05),見圖2b。進(jìn)一步通過Kaplan-MeierPlotter分析發(fā)現(xiàn),UBE2B高表達(dá)與腺癌患者的低總體生存率顯著相關(guān)(P<0.05),見圖2c,而鱗癌的低總體生存率無顯著性(P=0.081),見圖2d。圖2UBE2B表達(dá)量與食管癌患者生存率相關(guān)性圖3UBE2B與食管癌放化療效果相關(guān)性分析2.3UBE2B與食管癌放化療相關(guān)性分析腫瘤的治療是影響患者預(yù)后的重要因素。我們接著研究UBE2B對食管癌患者放療、化療影響。TCGA數(shù)據(jù)顯示,術(shù)后放療的患者UBE2B顯著低于未放療的患者(P<0.05),見圖3a,說明UBE2B可能是放療的靶基因。此外,GEO數(shù)據(jù)GSE45670顯示,放化療無反應(yīng)(non-responder)的患者UBE2B顯著高于放化療有反應(yīng)(responder)的患者(P<0.05),見圖3b,而且ROC曲線顯示UBE2B可以作為判斷食管癌患者放化療反應(yīng)的有效標(biāo)志物(AUC=0.77,P<0.05),見圖3c。此外,CCLE細(xì)胞數(shù)據(jù)庫也顯示,在食管癌細(xì)胞系中,UBE2B的基因效應(yīng)(geneeffect)與順鉑化敏感性顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),見圖3d,但是與5-氟尿嘧啶和紫杉醇無顯著相關(guān)(P>0.05),見圖3e～f。上述結(jié)果說明,UBE2B在食管癌中高表達(dá)可能通過影響患者的放化療效果而導(dǎo)致不良預(yù)后。2.4UBE2B與食管癌腫瘤中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析HPA數(shù)據(jù)庫中HPA數(shù)據(jù)集和Monaco數(shù)據(jù)集顯示,UBE2B在中性粒細(xì)胞中表達(dá)最高,具有相對特異性(見圖4a～b)。TIMER工具也顯示UBE2B與TCGA食管癌樣本的中性粒細(xì)胞免疫浸潤正相關(guān)(P<0.05),見圖4c,而且UBE2B的表達(dá)量與中性粒細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物CD66B(CEACAM8)以及CD11B(ITGAM)正相關(guān)(P<0.05),見圖4d～e。圖4UBE2B表達(dá)量與食管癌中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析2.5UBE2B與食管癌腫瘤T淋巴細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析T細(xì)胞免疫干預(yù)是目前常用的免疫治療手段。本研究發(fā)現(xiàn),UBE2B高表達(dá)與食管癌患者的CD8陽性T細(xì)胞顯著正相關(guān)(P<0.05),見圖5a,而與CD4陽性T細(xì)胞無顯著相關(guān)(P>0.05),見圖5b。此外,UBE2B與腫瘤免疫治療靶點PD-1(PDCD1)、PD-L1(CD274)、CTLA4正相關(guān),其中PD-L1(CD274)、CTLA4具有顯著性差異(P<0.05),見圖5c～e。上述結(jié)果說明UBE2B與食管癌免疫浸潤相關(guān),并且有可能作為食管癌免疫治療的潛在靶點。圖5UBE2B表達(dá)量與食管癌T淋巴細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析2.6抑制UBE2B的化合物及藥物預(yù)測為了提供通過干預(yù)UBE2B表達(dá)及活性來治療食管癌的線索,我們通過CTDbase預(yù)測靶向于UBE2B的藥物。共篩選出23種化合物或藥物能降低UBE2B表達(dá)及活性(見圖6),這些化合物或者藥物可以作為后續(xù)干預(yù)UBE2B治療食管癌提供線索。此外,預(yù)測結(jié)果包括常用化療藥物順鉑(cisplatin),這也從側(cè)面驗證了2.3結(jié)果中高表達(dá)UBE2B與食管癌患者的放化療反應(yīng)相關(guān)。圖6抑制UBE2B的化合物及藥物預(yù)測3討論食管癌作為當(dāng)今最常見的腫瘤之一,對它的治療已經(jīng)從傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療擴(kuò)展到結(jié)合腫瘤免疫手段進(jìn)行治療。以PD-1/PD-L1為靶點的免疫檢查點阻斷(Immunecheckpointblockade,ICB)治療可抑制負(fù)性調(diào)控信號,使T細(xì)胞從衰竭狀態(tài)中釋放出來,降低腫瘤免疫逃逸的可能性,逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境,從而顯著改善預(yù)后[10]。通過尋找耐藥或者免疫相關(guān)基因,可以為腫瘤的治療提供治療靶點。本文綜合利用表達(dá)分析、相關(guān)性分析、預(yù)后分析等生物信息學(xué)手段,首次證明了UBE2B在食管癌中高表達(dá)并且與患者的預(yù)后、放化療反應(yīng)、腫瘤免疫浸潤顯著相關(guān)。本研究通過權(quán)威數(shù)據(jù)庫TCGA分析發(fā)現(xiàn)UBE2B在食管癌中的高表達(dá),而且高表達(dá)UBE2B與患者的多種臨床參數(shù)顯著相關(guān),比如人種、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等,這意味著UBE2B一方面有可能在不同特征的食管癌中作用不同,一方面UBE2B的表達(dá)量有可能成為診斷不同臨床特征的食管癌亞型的標(biāo)志物之一。高表達(dá)UBE2B與低總生存率顯著相關(guān),這意味著UBE2B可能是食管癌的發(fā)病進(jìn)程的促進(jìn)因子,而且有可能作為食管癌預(yù)后的標(biāo)志物。腫瘤對治療的反應(yīng)是影響患者預(yù)后的重要因素。食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療僅限于手術(shù)或內(nèi)窺鏡切除和化學(xué)放射治療[11]。大約一半的食管癌患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這些患者主要通過化療方案進(jìn)行治療,如5-氟尿嘧啶、順鉑和他汀類藥物的組合[12]。然而,由于食管癌的異質(zhì)性,它本身就對化療有抵抗力。本研究發(fā)現(xiàn)UBE2B的表達(dá)量能夠被放療影響,而且可作為判斷放療、化療反應(yīng)性的有效標(biāo)志物。而且本研究也進(jìn)一步在食管癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)UBE2B的基因效應(yīng)與順鉑的敏感性成正相關(guān)。這就意味著我們也許可以通過干預(yù)UBE2B的表達(dá)實現(xiàn)改善食管癌患者放療、化療的效果,本研究最后也通過CTDbase預(yù)測了能干預(yù)UBE2B的化合物和藥物,為下一步研究提供線索。后續(xù)研究需要運用分子生物學(xué)實驗技術(shù)驗證UBE2B對食管癌放化療的作用,比如細(xì)胞系中敲低或過表達(dá)UBE2B后觀察細(xì)胞對放化療的反應(yīng),同時需要進(jìn)一步通過動物實驗、臨床試驗進(jìn)一步驗證。UBE2B與紫杉醇、5-氟尿嘧啶的敏感性雖然也是負(fù)相關(guān),但是無顯著性,這有可能是因為數(shù)據(jù)量不足引起,后續(xù)研究可以通過體外實驗,增加樣本量以確認(rèn)UBE2B對紫杉醇、5-氟尿嘧啶的影響。近年來,食管癌免疫療法一直在進(jìn)行臨床前或臨床研究,包括腫瘤疫苗接種、免疫檢查點抑制和采用T細(xì)胞療法等[13],越來越多的研究表明,免疫治療與化療相結(jié)合抑制劑比單獨免疫治療或者單獨化療更有效[14]。本研究發(fā)現(xiàn)UBE2B與食管癌CD8陽性淋巴細(xì)胞浸潤相關(guān),而且與PD-L1(CD274)、CTLA4相關(guān)。這意味著UBE2B與食管癌CD8陽性淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān),而且有可能作為免疫治療的潛在靶點。此外,本研究