3.基因工程的基本操作程序2第3課時課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性；2.檢測的內(nèi)容及方法:類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀（抗蟲、抗病等）病原體接種實驗等1.目的:04目的基因的檢測與鑒定

①檢測目的基因是否插入到受體細(xì)胞的染色體DNA上如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因檢測方法1：利用PCR對目的基因擴增后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取DNAPCR擴增是否擴增出目的基因M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；瓊脂糖凝膠電泳鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（1）分子水平檢測04目的基因的檢測與鑒定

檢測方法2：DNA分子雜交技術(shù)檢測工具：基因探針：帶有標(biāo)記（放射性同位素標(biāo)記或熒光分子標(biāo)記等）的單鏈核酸片段，能與目的基因的一條鏈發(fā)生堿基互補配對。基本思路：①檢測目的基因是否插入到受體細(xì)胞的染色體DNA上①制作基因探針,并用PCR擴增;②提取受體細(xì)胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；③高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。④如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中?；蛱结?原理：堿基互補配對原則)（1）分子水平檢測如：檢測Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNABtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄提取mRNAPCR擴增是否擴增出目的基因?qū)U增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定抗蟲棉逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA檢測方法1：PCR擴增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNART-PCR檢測方法2：分子雜交技術(shù)檢測基本思路1、制作基因探針，并用PCR擴增2、提取受體細(xì)胞全部mRNA，使基因探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明轉(zhuǎn)錄出了mRNA。（原理：堿基互補配對原則）②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA基因探針轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交分子（可檢測）變性蘇云金桿菌提取Bt抗蟲蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取抗原抗體雜交檢測方法：抗原-抗體雜交檢測Bt抗蟲蛋白③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)從轉(zhuǎn)基因生物提取出來的蛋白質(zhì)和相應(yīng)的抗體進(jìn)行雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因已經(jīng)翻譯。檢測原理：抗原與抗體特異性結(jié)合檢測內(nèi)容：轉(zhuǎn)基因生物是否具有相應(yīng)性狀（個體是否具有抗性以及抗性的程度）檢測方法：轉(zhuǎn)Bt基因非轉(zhuǎn)基因無抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株接種棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死目的基因表達(dá)抗蟲或抗病接種實驗基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較如：采摘抗蟲棉的葉子飼喂棉鈴蟲，觀察抗蟲效果。（2）個體水平的檢測轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常小結(jié)：個體水平的檢測抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等插入目的基因mRNA蛋白質(zhì)個體性狀轉(zhuǎn)錄翻譯表現(xiàn)分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定PCR等PCR等抗原-抗體雜交技術(shù)結(jié)果：是否出現(xiàn)雜交帶結(jié)果：出現(xiàn)雜交帶/陽性反應(yīng)給予相應(yīng)的環(huán)境培養(yǎng)①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——“抗原—抗體雜交技術(shù)”2.個體生物學(xué)水平鑒定1.分子水平檢測抗性檢測：功能活性比較：PCR技術(shù)DNA分子雜交技術(shù)抗蟲、抗病接種實驗；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較——檢測是否具有抗性以及抗性強度等如：胰島素注射到糖尿病模型小鼠體內(nèi)觀察血糖變化如：采摘抗蟲棉的葉子飼喂棉鈴蟲，觀察抗蟲效果。PCR技術(shù)分子雜交技術(shù)小結(jié)：目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定前提核心關(guān)鍵保證利用PCR獲取和擴增目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物);分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。第一步第二步第三步第四步四、目的基因的檢測與鑒定（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入到某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入到四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。延伸：篩選含目的基因的受體細(xì)胞（以大腸桿菌為例）四、目的基因的檢測與鑒定（2）受體細(xì)胞可能有：①含目的基因的細(xì)菌——無抗性②含目的基因—目的基因的細(xì)菌——無抗性③含質(zhì)粒的細(xì)菌——有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性④含質(zhì)?！|(zhì)粒的細(xì)菌——有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性⑤含重組質(zhì)粒的細(xì)菌——有氨芐青霉素抗性四、目的基因的檢測與鑒定（3）篩選方法：①將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌放在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)?！|(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落；②再利用滅菌的絨布影印到含四環(huán)素培養(yǎng)基上，不生長的即為含目的基因的菌落，如圖1、5。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。一、概念檢測1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因加整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）將加基因整合到Ti質(zhì)粒上就是構(gòu)建基因表達(dá)載體。（

）（2）構(gòu)建含有加基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（

）（3）只要檢測出番茄細(xì)胞中含有物基因，就代表抗凍番茄培育成功。（

）2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述錯誤的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C.復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補配對原則D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸√××D（1）科學(xué)家在培育“黃金大米”時，將ctrⅠ和psy基因?qū)牒琾mi基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建了質(zhì)粒pSYN12424。該項研究的目的基因是

，標(biāo)記基因是

，質(zhì)粒pSYN12424的作用是______。ctrⅠ基因和psy基因pmi基因?qū)⒛康幕蛩腿胨炯?xì)胞（2）在構(gòu)建質(zhì)粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。二、拓展應(yīng)用（限制酶不能切割目的基因）1.實驗原理（1）利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠________________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；②PCR擴增DNA片段還利用了_________________的原理；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動調(diào)控溫度30DNA半保留復(fù)制探究?實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定（2）DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著__________________的電極移動，這個過程就是_____；可解離的基團(tuán)pH電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過__________________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、________________和_____等有關(guān)④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為________的______下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象探究?實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理DNA分子中的磷酸基團(tuán)能解離出氫離子，剩下的部分（DNA的磷酸殘基）帶負(fù)電荷，因此DNA分子可從負(fù)極向正極遷移，DNA分子量越大，遷移的越慢。分子量大（長片段）分子量?。ǘ唐危㎝arker:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2.材料用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）PCR儀微量離心管微量移液器電泳裝置推動桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時，需要更換槍頭）2.材料用具10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）、瓊脂糖和核酸染料（需借助紫外燈觀察）等注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復(fù)融化導(dǎo)致活性降低甚至失活。2.材料用具3.方法步驟（1）DNA片段的擴增①移液：②離心：③反應(yīng)：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。可根據(jù)目的片段長度適當(dāng)調(diào)整延伸時間PCR實驗操作過程（2）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻②制備凝膠

將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。③加樣

將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。④電泳⑤觀察記錄3.方法步驟④電泳（2）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液②制備凝膠③加樣接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳⑤觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。②該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化③在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。④在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套。⑤PCR擴增不能隨意加大試劑用量。注意事項:（2）DNA片段的電泳鑒定DNA片段的電泳結(jié)果可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶,根據(jù)DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴增的結(jié)果一條條帶1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么