分子診斷技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用

分子診斷技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用微生物包括細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體、放線菌和真菌以及一些小型的原生生物等在內(nèi)的一大類生物群體，它們個(gè)體微小、種類繁多、與人類關(guān)系密切，廣泛用于食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)保等諸多領(lǐng)域。從醫(yī)療領(lǐng)域的角度來看，通過積極做好對(duì)于病原微生物的科學(xué)檢測，醫(yī)療人員可以依據(jù)檢測結(jié)果有效實(shí)現(xiàn)對(duì)于疾病的診療工作，這對(duì)人民群眾身體健康的保障具有良好的促進(jìn)作用。一、高通量測序高通量測序技術(shù)又稱“下一代”測序技術(shù)，以能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。高通量測序主要分為第二代邊合成邊測序、第三代單分子測序以及第四代納米孔測序等三類。在臨床領(lǐng)域中該技術(shù)具有較為明顯的技術(shù)應(yīng)用優(yōu)勢。對(duì)于結(jié)核病患者而言，由于結(jié)核桿菌痰涂片菌陽率低而痰培養(yǎng)耗時(shí)又長并且臨床用藥后影響檢出，嚴(yán)重影響了結(jié)核的診斷和治療，而高通量測序技術(shù)的應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)結(jié)核的早期診斷，對(duì)于患者后續(xù)診療工作具有良好的促進(jìn)作用。與此同時(shí)研究表明，該技術(shù)的合理應(yīng)用有利于幫助醫(yī)療衛(wèi)生部門合理實(shí)現(xiàn)對(duì)于流行性疾病暴發(fā)的科學(xué)防控。高通量測序技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于操作儀器設(shè)備和操作人員的專業(yè)能力與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)都具有較高的要求，相信在未來應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。二、核酸適配體技術(shù)核酸適配體是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。通常是利用體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。作為病原微生物檢測過程中的重要技術(shù)。核酸適配體技術(shù)在臨床工作中的應(yīng)用較為廣泛。核酸適配體技術(shù)主要通過技術(shù)手段對(duì)于樣本中的蛋白、酶、以及小分子物質(zhì)等寡核酸片段進(jìn)行獲取。該技術(shù)的應(yīng)用包括擴(kuò)增、調(diào)節(jié)以及分離、結(jié)合以及洗脫等五個(gè)環(huán)節(jié)。在此過程中，作為重要的組成環(huán)節(jié)之一，分離環(huán)節(jié)可以有效實(shí)現(xiàn)對(duì)于適配體靶分子的合理篩選。鑒于適配體的親和力較強(qiáng)且修飾難度偏低，因此，其可以在特定蛋白的適配體中進(jìn)行大面積應(yīng)用。該技術(shù)在臨床過程中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，在未來該技術(shù)有望取代抗體檢測技術(shù)。從現(xiàn)有研究的角度分析，近年來基因治療與特異性傳遞系統(tǒng)的發(fā)展均為該技術(shù)的蓬勃發(fā)展提供了強(qiáng)有力的保障。三、數(shù)字PCR技術(shù)數(shù)字PCR即（dPCR)，它是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。該技術(shù)主要借助了微球乳糜液化作用進(jìn)行檢測。通過將乳糜液在芯片微孔中進(jìn)行分散，有利于確保每個(gè)芯片微孔中都存在一個(gè)核酸模板，結(jié)合相應(yīng)的染料與試劑后微孔所釋放的光信號(hào)進(jìn)行捕獲和檢測。研究人員表示，通過相關(guān)檢測工作的全面落實(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸模板的檢出。在檢測期間通過對(duì)兩種信號(hào)的比例與數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢測人員可以得到明確的絕對(duì)定量。實(shí)踐表明該技術(shù)的優(yōu)勢在于其擺脫了定量PCR在檢測期間必須依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題，且降低了對(duì)于模板Ct值的依賴性。就目前而言，該技術(shù)憑借自身優(yōu)勢在臨床檢測過程中得到了廣泛的應(yīng)用，例如:在對(duì)巨細(xì)胞病毒、口腔病毒以及牛丘性疹性口炎病毒的檢測等。四、基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是同時(shí)將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對(duì)的特性對(duì)DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析，基因芯片技術(shù)主要從核酸分子雜交這一技術(shù)理論發(fā)展而來。在臨床過程中，基因芯片可以通過特殊的形式將核酸探針分子排列至經(jīng)過處理的硝酸纖維素膜表面。在此過程中，以光導(dǎo)原位合成法的應(yīng)用較為廣泛。排列完成后，可以使用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)于樣品的信號(hào)進(jìn)行判斷并依據(jù)其所發(fā)出的信號(hào)強(qiáng)弱對(duì)樣品中是否存在病原微生物進(jìn)行判斷。（五）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，在對(duì)病原微生物進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中，RAPD可以在基因組DNA區(qū)域中有效實(shí)現(xiàn)對(duì)于PCR的擴(kuò)增。但是，在應(yīng)用該物質(zhì)的過程中需要特別注意，其對(duì)于溫度有著嚴(yán)格的要求，需要處于低復(fù)性溫度下。為了有效實(shí)現(xiàn)對(duì)于檢測期間菌株基因組DNA特點(diǎn)的熟悉，相關(guān)檢測人員需要合理做好對(duì)于脈沖場凝膠電泳的妥善應(yīng)用。實(shí)踐表明通過相關(guān)技術(shù)的合理應(yīng)用，有利于檢測人員有效實(shí)現(xiàn)多態(tài)性檢測工作的開展，對(duì)于菌株分子分型鑒定具有良好的促進(jìn)作用。不過，在檢測期間，其對(duì)于相關(guān)對(duì)象的聚合酶類型指標(biāo)的要求相對(duì)較高。（六）DNA傳感器技術(shù)DNA傳感器器以DNA為敏感元件，通過換能器將DNA與DNA、DNA與RNA與DNA與其它有機(jī)無機(jī)離子之間的作用的生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測的光、電、聲波等物理信號(hào)。近年來，DNA傳感器在基因診斷、環(huán)境監(jiān)控、藥物研究等領(lǐng)域的應(yīng)用研究受到廣泛重視。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)病原微生物進(jìn)行檢測的過程中，檢測人員往往需要在傳感器中置入一條單鏈DNA，隨后檢測人員可以使用相關(guān)傳感器上的單鏈DNA與互補(bǔ)單鏈DNA進(jìn)行雜交的方式對(duì)于樣本的病原微生物進(jìn)行檢測。在這一檢測過程中，相關(guān)人員需要對(duì)于檢測信號(hào)進(jìn)行關(guān)注。（七）核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)目前在臨床和現(xiàn)場病原微生物快速檢測中具有良好發(fā)展前景的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)。LAMP是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶在等溫條件保溫30~60min，完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物利用熒光或濁度檢測進(jìn)行定量分析。該技術(shù)不依賴專門儀器，不需要熱循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過肉眼或濁度計(jì)判斷，靈敏度和特異性均優(yōu)于常規(guī)PCR，成本遠(yuǎn)低于定量PCR，但靶序列最好控制在300bp以內(nèi)，同時(shí)由于該技術(shù)靈敏度高，極易被污染而造成高假陽性等問題。目前，LAMP技術(shù)在丙型肝炎病毒、乙腦病毒、甲型流感病毒和腮腺炎病毒，以及細(xì)菌、支原體等檢測領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。（八）多重PCR技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上通過增加引物對(duì)數(shù)，衍生出多重PCR技術(shù)。常規(guī)PCR僅采用一對(duì)引物，而多重PCR則可在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增多個(gè)目的基因。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定，也廣泛應(yīng)用于某些遺傳病及癌基因的分型鑒定，如肝炎病毒、腸道致病性細(xì)菌、性病、戰(zhàn)傷細(xì)菌及生物戰(zhàn)劑細(xì)菌和需特殊培養(yǎng)的無芽孢厭氧菌檢測等。（九）定量PCR技術(shù)該技術(shù)利用熒光染料或熒光探針，對(duì)擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確定量樣品初始DNA拷貝數(shù)。該技術(shù)的核酸擴(kuò)增和檢測在同一體系中進(jìn)行，避免了開蓋檢測造成的污染；產(chǎn)物無需電泳，特異性好、靈敏度和自動(dòng)化程度高；具有可與生物芯片或免疫磁珠等技術(shù)聯(lián)用等優(yōu)勢。定量PCR技術(shù)已成為臨床病原微生物檢測的常規(guī)手段之一，廣泛用于乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒和流感病毒等檢測，但如何進(jìn)一步加強(qiáng)該技術(shù)的質(zhì)量監(jiān)管體系建設(shè)、減少或抑制操作過程中的干擾因素等，是擺在其面前的主要挑戰(zhàn)。該技術(shù)主要分為雙鏈摻入法、Taqman探針、分子信標(biāo)和雙雜交探針等。隨著分子診斷技術(shù)的合理應(yīng)用與普及，我國醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)Σ≡⑸锏臋z測綜合水平得到了顯著