高品質免疫類診斷試劑原料的開發(fā)與制備

高品質免疫診斷試劑原料的開發(fā)與制備杜冰北京義翹神州科技股份有限公司高級研發(fā)經(jīng)理義翹神州簡介體外診斷試劑相關概述1免疫類原料的工藝開發(fā)流程2免疫類原料開發(fā)相關案例3免疫類原料開發(fā)的重點與挑戰(zhàn).4義翹神州體外診斷試劑相關概述01義翹神州IVD主要技術分類及市場＊數(shù)據(jù)來源：

羅氏診斷2019年技術手段全球市場國內(nèi)市場生化診斷17%20%免疫診斷23%35%分子診斷19%25%POCT20%5%其他21%15%體外診斷的價值IVD占~2%全球醫(yī)療支出IVD影響>60%臨床醫(yī)療關鍵決策義翹神州2017-2025年全球體外診斷行業(yè)市場規(guī)模（百萬美元）2018-2022年國內(nèi)體外診斷行業(yè)市場規(guī)模（百萬元）2018-2022年國內(nèi)免疫診斷細分行業(yè)市場規(guī)模（百萬元）資料來源：中國藥品監(jiān)督管理研究會、高禾投資研究中心IVD行業(yè)市場規(guī)模及增速義翹神州＊數(shù)據(jù)參考：

前瞻產(chǎn)業(yè)研究院體外診斷產(chǎn)業(yè)鏈上游原材料：抗原/抗體、酶/微球/NC膜/電子元器件高端原料進口為主供應鏈風險中游產(chǎn)品：診斷試劑診斷儀器高端封閉分級診療下游流通競爭格局分散集采壓力醫(yī)院檢驗科第三方檢驗/診斷體檢中心/防疫站/血站義翹神州IVD國內(nèi)年復合增長率在10%以上原料開發(fā)處于產(chǎn)業(yè)鏈的上游環(huán)節(jié)高品質的原料對于產(chǎn)品質量的影響很大診斷試劑的靈敏度和特異性基本由原料決定原料的可靠性、穩(wěn)定性及一致性是產(chǎn)品成功的關鍵體外診斷原料的總體情況義翹神州免疫類原料的工藝開發(fā)流程02義翹神州生化診斷免疫診斷分子診斷POCT

生化酶抗原抗體抗原抗體抗原抗體分子酶擴增酶連接酶反轉錄酶體外診斷檢測方法分類及關鍵生物原材料義翹神州常見免疫診斷檢測平臺免疫診斷原料（抗原和抗體）化學發(fā)光平臺腫瘤、甲功、傳染病、激素、心臟標志物、代謝和貧血等POCT平臺血氣、電解質、炎癥、心臟標志物、傳染病、糖化血紅蛋白免疫比濁平臺（生化）免疫球蛋白、補體、載脂蛋白、C-反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A、降鈣素原、銅藍蛋白等、類風濕因子尿微量白蛋白、微球蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白、前白蛋白等義翹神州表達量低聚集包涵體降解活性表達序列優(yōu)化表達載體選擇轉染條件表達宿主選擇目的蛋白粗提方案精純方法獲得高純度蛋白抗原開發(fā)中的常見問題重組抗原開發(fā)的關鍵環(huán)節(jié)義翹神州重組抗原開發(fā)技術-表達宿主義翹神州大腸桿菌優(yōu)點缺點酵母優(yōu)點缺點昆蟲桿狀病毒優(yōu)點缺點哺乳動物優(yōu)點缺點經(jīng)濟快速高產(chǎn)量最常用難表達大分子蛋白無后修飾包涵體經(jīng)濟快速高產(chǎn)量有后修飾蛋白后修飾高產(chǎn)量高細胞密度可溶蛋白周期長缺少部分糖基化成本高蛋白后修飾可溶蛋白周期長成本高非人源糖基化高甘露糖修飾分泌抗原胞內(nèi)抗原膜抗原細胞裂解膨脹法去污劑破膜法高壓勻漿破碎法超聲破碎法固液分離高速離心深層過濾微濾超濾粗純親和純化:鎳柱離子交換疏水層析精純親和純化離子交換疏水層析凝膠層析重組抗原開發(fā)技術-純化工藝義翹神州免疫篩選抗體純化應用鑒定免疫原選擇免疫原制備免疫方案劑量、途徑、佐劑、周期等高通量多種篩選方法蛋白A/G抗原親和純度內(nèi)毒素WB、IHC、FCM等特異性識別多種天然樣本抗體原料開發(fā)技術-基本流程義翹神州雜交瘤噬菌體展示文庫B細胞Beacon細胞易獲得識別天然構象的抗體電融合較PEG融合效率有大幅提升高效的抗體開發(fā)技術平臺：經(jīng)典技術優(yōu)化：電融合，建庫技術新技術：單個B細胞技術，更快的速度多種篩選方案組合高效的重組抗體表達重組蛋白優(yōu)選系統(tǒng)表達（更近天然）核酸無需表達蛋白、節(jié)約時間易獲得識別天然構象的抗體快速免疫、常規(guī)免疫不同免疫部位、劑量、佐劑組合免疫動物多樣化：兔、小鼠、山羊、豚鼠高質量的候選抗體庫：數(shù)百-數(shù)千個候選抗體親和力達到nM-pM水平不同的抗原結合表位適用于不同應用場景四大抗體制備技術平臺多種免疫原多種免疫方案抗體原料開發(fā)技術-技術平臺義翹神州抗體原料開發(fā)技術-檢測平臺組織水平組織水平天然樣本細胞裂解液蛋白分子水平CD71（11020-R016）胎盤CD147（10186-R125）食道IHCAnti-CD3-FITC(CT026-R301-F)Anti-CD4-APC(10400-MM008-A)Anti-CD19(11880-MM17)PDXDC1(202952-T46)KLC3(202063-T020)FCMIFELISAE-Cadherin(10204-T52)GSTK1(14291-T52)WBIPBiacore檢測Octet檢測義翹神州ELISA方法-抗原表位檢測膠體金檢測時間分辨熒光檢測乙型流感檢測靈敏度可達到50pg/mLIL-6檢測靈敏度可達到10pg/mL抗體原料開發(fā)技術-應用檢測平臺義翹神州T/C值掃描位置大豆Glym4過敏原37℃加速穩(wěn)定性結果3個批次生產(chǎn)過程一致性高品質產(chǎn)品的保障-穩(wěn)定性和批間差義翹神州新冠N蛋白抗體生產(chǎn)百分比時間（天）時間（天）活性OD值免疫類原料開發(fā)相關案例03義翹神州致敏過程反應過程過敏免疫診斷是檢測體內(nèi)sIgE抗體室內(nèi)過敏原（寵物、塵螨、霉菌、蟑螂等）室外過敏原（花粉、霉菌等）食物（牛奶、雞蛋、花生等）注射類過敏原（昆蟲、藥物等）·國內(nèi)過敏性患者約2億（哮喘5000萬、過敏性鼻炎1億）·過敏性疾病發(fā)病復合年增長率>20%·吸入類：塵螨>蟑螂>貓毛>艾蒿過敏的概況參考來源：KubyImmunologySixthEdition義翹神州FeldI分子設計異源二聚體兩個亞基在同一個表達框內(nèi)FeldI優(yōu)化策略MR使用原核系統(tǒng)表達，自然折疊酵母表達有糖基化位點，可能影響活性異源二聚體或者四聚體，且活性較好FeldI產(chǎn)品特點實例1.貓過敏原FeldI開發(fā)分子結構DNA序列優(yōu)化載體選擇宿主菌表達條件優(yōu)化前處理層析填料選擇層析流程優(yōu)化靶點分析重組表達純化工藝可溶表達90%純度高活性義翹神州樣品測試實例2.重組雞蛋過敏原Gald1的開發(fā)E.coliP.pastoris293cellGald1開發(fā)表達量低與sIgE反應弱純化后3條帶與sIgE反應弱條帶彌散與sIgE反應良好66.211645.035.025.018.414.4MRNR11666.245.035.025.018.414.4MRNR11666.245.035.025.018.414.4MRNR優(yōu)選原料表達系統(tǒng)工藝開發(fā)義翹神州義翹神州

過敏原貨號名稱分子塵螨69028-A08HDermatophagoidesfarinaeDERF1Protein(HisTag)Derf169029-A07EDermatophagoidesfarinaeDERF2Protein(HisTag)Derf269007-A08HDermatophagoidespteronyssinusDERP1Protein(HisTag)Derp169014-ANAEDermatophagoidespteronyssinusDERP10ProteinDerp1069005-A07EDermatophagoidespteronyssinusDerp2protein(HisTag)Derp2熱帶螨69061-A08YBlomiatropicalisBlot1Protein(HisTag)Blot169062-A08HBlomiatropicalisBlot2Protein(HisTag)Blot2狗70257-D08HCanineCanf1Protein(HisTag)Canf1306-CAN0010RecombinantCanisfamiliarisAllergenCanf4Canf4貓301-FELDI0010RecombinantFelisdomesticusallergenFeld1Feld1301-FELDI0030RecombinantFelisdomesticusAllergenFeld4Feld4蟑螂69030-A07EBlattellagermanicaBlag1Protein(HisTag)Blag1320-BLA0010RecombinantCockroachesallergenBlag4Blag4美洲大蠊69031-A08EPeriplanetaamericanaPera1Protein(HisTag)Pera1歐洲白樺69044-A07EBetulapendulaBETV4Protein(HisTag)Betv4335-BET0010RecombinantBetulaverrucosaAllergenBetv2Betv2法國梧桐323-PLA0020RecombinantPlatanusacerifoliaAllergenPlaa1Plaa1323-PLA0030RecombinantPlatanusacerifoliaAllergenPlaa2Plaa2323-PLA0060RecombinantPlatanusacerifoliaAllergenPlaa3.02Plaa3豚草302-AMBA0040RecombinantAmbrosiaartemisiifoliaallergenAmba1Amba1艾蒿69035-A08HArtemisiavulgarisMajorpollenallergenArtv1Protein(HisTag)Artv1324-ART0050RecombinantMugwortAllergenArtv4.02Artv4歐蓍草69050-A08HParietariajudaicaAllergenParj2.0101Protein(HisTag)Parj2梯牧草69047-A07HPhleumpratensePhlp2Protein(HisTag)Phlp269048-A07HPhleumpratensePhlp5Protein(HisTag)Phlp5葎草333-HUM0010RecombinantHumulusscandenAllergenHums1Hums1鏈袼孢69006-ANAEAlternariaalternateALTA1proteinAlta1煙曲霉69009-A08HNeosartoryafumigataAspf1Protein(HisTag)Aspf1321-ASP0010RecombinantAspergillusFumigatusallergenAspf15Aspf15321-ASP0040RecombinantAspergillusFumigatusallergenAspf22Aspf22附表1：吸入類過敏原義翹神州

過敏原

貨號名稱分子八大類小麥305-TRIA0020RecombinantwheatallergenTria14Tria14大豆304-GLYM0010RecombinantGlycinemaxallergen4,soybeanGlym4蝦318-MET0020RecombinantMetapenaeusensisAllergenMete1Mete1魚307-GADC0020RecombinantGadusmorhuaallergenGadc1Gadc1蟹308-SCY0110RecombinantScyllaparamamosainallergenScyp1Scyp1雞蛋322-GAL0030RecombinantGallusGallus(Chicken)allergenGald1Gald1牛奶325-BOS0020RecombinantBosdomesticusAllergenBosd2Bosd2花生303-ARAH0010Recombinant

peanut

allergen

Ara

h

9.0101Arah9核桃314-JUG0010RecombinantJuglansregiaAllergenJugr1Jugr1榛子69057-ANAECorylusavellanaCora1ProteinCora1巴西堅果317-BER0010RecombinantBertholletiaexcelsaAllergenBere1Bere1芝麻319-SES0010RecombinantSesamumindicumallergenSesi1Sesi1水果獼猴桃312-ACT0020RecombinantActinidiadeliciosaAllergenActd8Actd8蘋果309-MAL0020RecombinantMalusdomesticaAllergenMald1Mald1草莓311-FRA0020RecombinantFragariaananassaAllergenFraa1Fraa1昆蟲蜂蜜329-VES0040RecombinantVespulavulgarisAllergenVesv5Vesv5動物馬326-EQU0010RecombinantEquuscaballusAllergenEquc1Equc1兔子327-ORY0030RecombinantOryctolaguscuniculusAllergenOryc3Oryc3鼠328-RAT0030RecombinantRattusnorvegicusAllergenRatn1Ratn1附表2：食入類過敏原甲乙流毒株+重組蛋白免疫動物+小鼠/兔子效價測定+免疫器官分離ELISA經(jīng)典、快速、批量化膠體金簡便、直觀、快速時間分辨熒光快速半定量樣本應用驗證雜交瘤4大抗體制備平臺噬菌體展示文庫Beacon單B細胞抗體發(fā)現(xiàn)抗體篩選全面覆蓋靶點：H1N1、H3N3、H5N7適用多種應用：ELISA、WB、中和篩選儲備單抗：200+株抗體發(fā)現(xiàn)特點：經(jīng)典流程多種方式注意細節(jié)擴大庫容抗體篩選特點：技術多樣結合實際應用特異性更強靈敏度更高實例3.甲乙流病毒層析抗體的開發(fā)義翹神州抗體：40208-R014(標金)-40208-R061（劃線）抗原：40205-V08B靈敏度：100pg/mL甲流乙流抗體：40438-R036（標金）-40438-MM10（劃線）抗原：40438-V08B靈敏度：50pg/mL義翹神州抗體：10395-MM72（標記）10395-R058（劃線）抗原：

10395-HNAE靈敏度：10pg/mL10pg/mL的靈敏度（12.75>4.97）25-500pg/mL范圍內(nèi)，IL-6定量檢測試紙條線性良好，相關系數(shù)(R)為0.9985。實例4.炎癥風暴IL-6抗體的開發(fā)-時間分辨熒光義翹神州BNumberofPoints5DegreesoofFreedom3ResidualSumofSquares0.00893Pearson’sr0.99859RValue0.99859Adi.R-Square0.99623T/C值掃描位置免疫類原料開發(fā)的難點與挑戰(zhàn)04義翹神州04重組抗原形成接近天然抗原的結構抗原活性良好檢測結果更加可信抗原結構分析分子構建設計更適合的表達系統(tǒng)選擇蛋白純度是基礎減少雜質干擾提升穩(wěn)定性優(yōu)化蛋白表達和純化工藝包涵體的純化和復性折疊策略其他穩(wěn)定劑（表面活性劑等）抗原開發(fā)的核心問題-與天然蛋白一致純度得率活性穩(wěn)定性高品質抗原義翹神州得率嘗試多種表達系統(tǒng)（目的蛋白表達的相對含量會有差異）優(yōu)化不同的培養(yǎng)條件（DO、溫度、pH等）細胞破碎方法（超聲、高壓均質等）活性緩沖液體的離子強度純化步驟設計（層析填料選擇、層析順序）融合蛋白或親和標簽的影響穩(wěn)定性減少釋放的任何蛋白酶確定穩(wěn)定性時效跟蹤評價蛋白的穩(wěn)定性義翹神州抗原開發(fā)的核心問題-與天然蛋白一致抗體開發(fā)中的問題采用多種免疫原進行免疫（蛋白、核酸、細胞等）采用多種抗體制備手段盡可能的制備較大的抗體篩選庫由抗體的開發(fā)和篩選過程決定，幾