義翹講堂《核酸酶及其“全生命周期”的質量控制要點》

核酸酶及其“全生命周期”的質量控制要點北京義翹神州科技股份有限公司核酸酶及其質量控制1核酸酶使用困境2核酸酶的活性檢測3核酸酶的殘留檢測4義翹神州核酸酶系列產品5義翹神州藥品生產中核酸酶原料的質量控制核酸酶原料儲存穩(wěn)定性核酸酶工作液穩(wěn)定性穩(wěn)定性入廠質控酶工作液活性研究工作液配制工作液穩(wěn)定性研究同類酶可比性研究原料安全性酶在工藝條件活性評價核酸酶去除工藝研究工藝活性SuperNucleaseELISAKitCat:KIT-SSNP01總酶量殘留（工藝雜質）義翹神州總活酶-20℃2-8℃室溫存儲條件2-8℃室溫核酸酶是生產關鍵原料，核酸酶的質量控制對工藝穩(wěn)定性和終產品質量至關重要《國家藥典委員會關于征求核酸酶殘留量檢測方法驗證意見的函》2023.04.26核酸酶及其質量控制01義翹神州核酸酶SuperNuclease-DNA結構模型短ssDNA核酸酶SaltactiveSuperNuclease-DNA結構模型殘留宿主DNA危害：致癌、感染國內疫苗：0.01-10ng/劑治療性生物制品：10ng/劑單抗注射液：0.1ng/劑國際0.1-10ng/劑,長度<200bp宿主DNA殘留控制粘滯沙雷氏菌非特異性核酸酶耐鹽/嗜鹽非特異性核酸酶（海洋生物）其他（義翹神州可為客戶定制開發(fā)）降低宿主DNA風險降低料液粘度提高下游層析載量140+核酸酶及突變體庫基于需求和結構的理性設計經驗單批90+突變體篩選通量義翹神州高聚DNA低鹽（50mMNaCl）具有最適活性高鹽（500mMNaCl）具有最適活性核酸酶的質量義翹神州檢項：性狀、鑒別、蛋白質含量、活性、純度、微生物限度限量控制參數：1）純度2）比活性指每1mg質量的蛋白質中所含重組胰蛋白酶的活性，應不低于3800U/mg蛋白質3）微生物限度《中國藥典》2020版重組胰蛋白酶有效性指標比活性（U/mg）體積活性（U/μL）活性蛋白質含量鑒別核酸酶的關鍵質量屬性優(yōu)質核酸酶特征：高比活性、低雜質風險、易去除安全性指標純度微生物限度其他雜質

-內毒素-TritonX-100-抗生素-動物源雜質核酸酶是工藝雜質需要從終產品中去除核酸酶比活性測定義翹神州比活性（U/mg）指單位質量蛋白質的酶活力單位數，通過計算獲得。蛋白濃度測定《中國藥典》2020版通則0731第四法BCA法80-400μg，受甘油和還原劑影響第五法Bradford法1-200μg蛋白，受TritonX-100影響第六法紫外-可見分光光度法0.2~2mg/mL，需要測定吸收（消光）系數酶活力測定（缺乏統(tǒng)一的方法）特定檢測檢測溫度、反應時間特定緩沖液pH、緩沖液組成、添加劑（金屬離子、特定濃度無機鹽、表面活性劑等）特定底物濃度、類型、狀態(tài)（聚集態(tài)、子量分布等）特定方法特定條件（酶活力單位定義條件）酶的比活性屬酶含量范疇，只在特定條件下數值等同于酶的活性核酸酶使用困境02義翹神州核酸酶的使用困境義翹神州FAQ200/300mMNaCl濃度下耐鹽酶和不耐鹽酶誰更好？A酶

比B酶

活性更好嗎？你們的核酸酶和xxx品牌的有什么差異？可以替換使用嗎？我應該加多少酶才能保證宿主殘留合格？核酸酶容易去除嗎？……DMEM細胞培養(yǎng)液/250mMNaCl,Tris緩沖液等37℃，pH8.5，500mMNaCl

Tris-HCl緩沖液，50mM小牛胸腺DNA檢測A260上升1.0的酶量為1U≠工藝條件活性SASNSN如何選擇合適的酶？不同來源的核酸酶的酶學性質可能具有顯著差異酶的比活性不能直接用于衡量工藝條件下酶的活性義翹神州SASNSNSASNSN真實活性相對活性比活力比活力核酸酶的使用困境相對活性不能作為指導酶使用的依據應依據真實活性選擇適宜的酶相對活性核酸酶的使用困境義翹神州困境原因核酸酶工藝條件活性難評估酶活定義條件與工藝條件差異真實底物與酶活測定底物不同高成本使用條件不當過量使用基于宿主殘留檢測酶活性質控難、同類產品難以比較缺乏高效測活方法缺乏統(tǒng)一標準（方法、定義）核酸酶殘活檢測現有方法不易用核酸酶活性檢測03義翹神州核酸酶測活方法1.0（紫外-可見光分光光度法）高聚雙鏈dsDNA（小牛胸腺DNA、魚精DNA）當A260(10mm)=1時，dsDNA：50μg/mLssDNA：33μg/mL*GironK.etal.NEBTechnicalNotessDNA3-5nt核酸酶影響因素：測試條件：底物類型和濃度、溫度、緩沖液組成檢測儀器和容器材質操作：稀釋方法、終止方法上市產品采用方法，各家試驗細節(jié)、定義條件具有差異義翹神州魚精DNA水甘油高聚底物粘度高難以準確吸取優(yōu)點：直接檢測酶活性，不依賴酶參考品缺點：穩(wěn)定性、重現性較差核酸酶測活方法2.0（熒光底物法）義翹神州*ThermoScientific:DNaseAlert?QCSystem優(yōu)點：底物均一性好，板內精密度高；靈敏度高主要問題：無國家/國際標準品，依賴DNaseI酶參考品1）DNaseI穩(wěn)定性風險2）不同酶間酶學性質差異數據處理復雜需要單獨處理每個試驗點的酶活曲線核酸酶殘留檢測04義翹神州核酸酶殘留檢測方法——ElisaSuperNucleaseELISAKitCat:KIT-SSNP01高線性區(qū)間：

46.9-3000pg/mL板間精密度：<10%板內精密度:<5%靈敏度：27.3pg/mLIntra-assayPrecisionInter-assayPrecisionSample123123N202020333Mean(pg/mL)11031420611363732137SD10.916.365.76.712.659.6CV(%)9.9%5.2%3.2%4.9%3.4%2.8%義翹神州核酸酶殘留檢測方法——酶活義翹神州《國家藥典委員會關于征求核酸酶殘留量檢測方法驗證意見的函》

2023.04.23建議使用酶活性殘留檢測方法檢測核酸酶殘留推薦使用熒光法法規(guī)趨勢義翹神州核酸酶系列產品05義翹神州Cat:

GMP-SSNP01Cat:

GMP-SASN-AF義翹神州核酸酶系列產品核酸酶活性檢測試劑盒核酸酶定制開發(fā)服務核酸酶活性檢測服務（特定工藝條件下、穩(wěn)定性等）基于核酸酶的核酸去除工藝開發(fā)服務義翹神州預計2024Q1上市酶質量控制酶殘留檢測服務基于Elisa的蛋白殘留檢測SuperNucleaseELISAKitCat：KIT-SSNP01SaltactiveSuperNucleaseELISAKit預計2024Q1上市活性酶殘留檢測核酸酶活性檢測試劑盒SuperNucleaseSaltActiveSuperNuclease義翹神州核酸酶系列產品預計2024Q1上市義翹神州SuperNuclease（SSNP）SaltActiveSuperNuclease（SASN）核酸酶適用條件生理鹽高活性中高鹽高活性比活力義翹神州提供了主要使用場景全覆蓋的兩款核酸酶產品生理鹽高活性酶SuperNuclease義翹神州SuperNuclease對真實樣本宿主核酸去除效果與競品相當SuperNuclease和Benzonase具有相同的抗原表位，二者Elisa檢測試劑盒可通用貨號特點GMP-SSNP01高濃度、無甘油GMP-SSNP01-G低濃度、具有甘油GMP-SSNP01-AF高濃度、無甘油、無動物源粘滯沙雷氏菌核酸酶生產未使用抗生素具有無動物源產品GMP級別DMF備案（MF035978）SuperNuclease性能、蛋白特征與進口全能核酸酶相當中高鹽高活性酶SaltActiveSuperNuclease義翹神州25℃,pH7.5測試條件：20mMTris-HCl緩沖液，25-37℃，pH7.5-8.5，150-600mMNaCl37℃,pH7.537℃,pH8.5嗜鹽菌核酸酶GMP級別未使用動物源原料完全未使用抗生素室溫4個月以上穩(wěn)定高等電點，易去除中高鹽條件比活性優(yōu)于已上市競品200-600mM比活力比活力比活力SaltActiveSuperNuclease具有自主知識產權，性能領先于同類產品SASN的宿主DNA去除能力義翹神州1.0x107cell/mLCHO細胞破碎液

375

pg酶處理1小時《中國藥典》方法檢測宿主核酸殘留2.5x107cell/mL293細胞濃縮液破碎液

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pg酶處理0.5小時商品化宿主殘留檢測試劑盒測定等量酶處理細胞破碎液，義翹神州SASN效果優(yōu)于進口競品A競品A（進口）競品A（進口）核酸酶活性質控方法核酸酶原料儲存穩(wěn)定性核酸酶工作液穩(wěn)定性穩(wěn)定性入廠質控酶工作液活性研究工作液配制工作液穩(wěn)定性研究同類酶可比性研究原料安全性酶在工藝條件活性評價核酸酶去除工藝研究工藝活性殘留（工藝雜質）義翹神州總活酶-20℃2-8℃室溫存儲條件2-8℃室溫《國家藥典委員會關于征求核酸酶殘留量檢測方法驗證意見的函》2023.04.26可以為核酸酶“全生命周期”服務的合規(guī)、穩(wěn)定、高重現性、易操作的核酸酶活檢測方法義翹神州核酸酶活性檢測試劑盒將紫外-可見光分光光度法和傳統(tǒng)熒光法優(yōu)勢互補，依托國家標準品建立了新型熒光底物檢測方法義翹神州方法紫外-可見光分光光度法熒光底物法義翹神州熒光底物法酶活檢測直接間接直接參考品無自制DNaseI國家熒光標準品底物多聚DNA均一性差、批間差大單/雙鏈熒光底物均一性高雙鏈熒光底物均一性高、批間差低*靈敏度低高高穩(wěn)定性一般一般高重現性一般一般高便利性低一般高殘留檢測&定性限不適用0.5pg（DNaseAlert?QCSystem）0.4pg*所有底物經過特有方法完成結構確認、精確定量&使用DNaseI酶，37℃，30分鐘檢測，按照藥典要求以3倍信噪比定定性限義翹神州核酸酶活性檢測試劑盒義翹神州使用國家標準品制作標準曲線線性回歸計算酶活簡單的操作流程BCA法測蛋白濃度義翹神州核酸酶測活試劑盒酶標儀、qPCR儀、微量熒光光度計均適用像測定蛋白濃度一樣，簡單的核酸酶活檢測方法，半天內可完成方法學確認核酸酶殘留檢測方法——方法學驗證藥典項目藥典要求熒光法驗證報告一、專屬性檢測雜質對反應的影響5%以內TritonX100和Tween20等表面活性劑；20mM以內HEPES和磷酸鹽對反應無影響。*二、準確度回收率：75-120%回收率：97-101%三、精密度重復性RSDr＜8%RSDr:1.9-2.9%中間精密度考察不同時間、人員、設備的精密度差異人間精密度：RSD：0.4-2.1%時間精密度：RSD＜

5%重現性RSDR<16%實驗室間RSDR=3.9%四、檢測限信噪比3:10.4pmol產物量*五、定量限信噪比10:11.2pmol產物量六、線性應列出回歸方程等線性回歸，R2>0.996七、范圍根據二~六確定1.2-10.1pmol產物量八、耐用性考察測定條件小變動影響底物凍融8次不影響結果5-60分鐘操作均符合要求義翹神州產品即將上線，歡迎試用！根據《中國藥典》要求完成方法學驗證，靈敏度高、穩(wěn)定性好、重現性高*針對SASN酶活檢測試劑盒應用—酶原料活性檢定pmol/minx10-3U*0.5521.00.4918.40.3814.70.217.40.113.70.082.5試劑盒可用于酶原料質控、酶穩(wěn)定性研究等酶原料及溶液的活性質量控制不同濃度競品A的酶活檢測結果*根據競品A的COA文件數據計算38.6x10-3U的酶在檢測條件下的活性是1pmol/min應用場景1：核酸酶活性定量（入廠原料質控、中間品穩(wěn)定性研究……）酶活檢測試劑盒應用—同類產品比較使用試劑盒方法測定計算新酶用量，新酶處理效果與原工藝用酶相當應用場景2：根據A酶用量推算B酶用量酶比活力（x106RFU/mg)蛋白濃度（mg/mL)體積酶活（x103RFU/μL)工藝用酶量（x103

RFU/mL)工藝用酶量（μL酶/L發(fā)酵液）A（濃溶液）10840.811485148100B（稀溶液）14090.46958155測定兩種酶的體積酶活根據A酶工藝用量（μL/mL）和兩種酶體積酶活計算B酶工藝用量酶活檢測試劑盒應用—核酸去除工藝優(yōu)化高效確認工藝變更后核酸酶加量，推動核酸酶相關工藝開發(fā)應用場景3：核酸去除工藝條件優(yōu)化后的工藝確認——酶使用量確認比活力（x106RFU/mg)體積酶活（x103RFU/μL)NaCl

（mM）溫度

（℃）吐溫-20

（v/v)使用體積(μL/L)31409958500370.5%155834567250370.5%262477324150370.5%45811878075003701848856022503702475293601503704131245846500250.5%175709482250250.5%308349237150250.5%6261078733500250203588400250250371266181150250