TCAAA 112-2023 梅花鹿胚胎冷凍技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30T/CAAA112—2023梅花鹿胚胎冷凍技術(shù)規(guī)范2023-10-10發(fā)布2023-11-30實(shí)施中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)提出并歸口。黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院、哈爾濱工業(yè)大學(xué)、新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、根河森林工業(yè)有限公司?！疚募饕鸩萑耍喉n歡勝、趙列平、趙曉靜、許艷麗、道楞、郭喜明、王雪、王敏、孫義樂、許震、吳曉宇、孫麗英、蓋廣輝、黃海燕、趙育國(guó)、杜佩澤、尚念鵬。—1梅花鹿胚胎冷凍技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了梅花鹿冷凍胚胎生產(chǎn)基本要求、超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎檢查及凍前處理、胚胎冷凍與貯存。本文件適用于梅花鹿胚胎的冷凍保存。2規(guī)范性引用文件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本NY/T1900-2010畜禽細(xì)胞和胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4基本要求4.1.1由鹿保定人員、操作助手、采胚人員、胚胎檢測(cè)人員組成。4.1.2具有一定的專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)和現(xiàn)場(chǎng)工作經(jīng)驗(yàn)，無人獸共患傳染病。4.1.3應(yīng)事先分工，操作過程中須密切配合。4.1.4操作中應(yīng)嚴(yán)格消毒，戴手套，穿工作服。4.2操作室4.2.1具有采胚、檢胚、凍胚的功能分區(qū)。4.2.2應(yīng)安全、通風(fēng)、保溫和衛(wèi)生，設(shè)照明、電源插座和操作臺(tái)，面積15m2~25m2為宜。4.2.3墻壁、地面應(yīng)采用便于消毒、防水的材質(zhì)。4.2.4操作前應(yīng)采用無刺激性氣味的消毒液和紫外線燈進(jìn)行消毒殺菌。4.3藥品器械4.3.1操作前備齊藥品與器械，具體參見附錄A。4.3.2接觸胚胎的器皿應(yīng)清潔衛(wèi)生。4.3.3消毒后的器械應(yīng)用鋁箔紙或封口紙封好備用。4.4供體鹿4.4.1健康。4.4.2生殖器官機(jī)能正常。4.4.3體況良好、中上等。4.4.4經(jīng)產(chǎn)母鹿，產(chǎn)后120d以上。5超數(shù)排卵5.1季節(jié)2T/CAAA112—2023超數(shù)排卵宜9月份至12月份進(jìn)行。超數(shù)排卵前應(yīng)對(duì)供體鹿補(bǔ)飼20d以上，主要補(bǔ)飼維生素A、維生素D、維生素E、硒、鋅等維生素和微量元素。5.3.1方案：宜采用CIDR+FSH方案，具體程序參見附錄B。5.3.2埋栓和取栓：埋置陰道孕酮緩釋栓(controlledinternaldrugreleasing;CIDR),埋置當(dāng)天記為第0d,第9d開始注射促卵泡素(follicle-stimulatinghormone;FSH),以后每天早晚各注5.3.3人工輸精：取栓后采用公鹿試情結(jié)合行為觀察的方法進(jìn)行發(fā)情鑒定，母鹿從接受試情公鹿爬跨到拒絕爬跨行為變的較安穩(wěn)時(shí)進(jìn)行第1次輸精，間隔6h～8h進(jìn)行第2次輸精。6胚胎采集6.1應(yīng)在人工輸精后6d～7d采集胚胎。采胚操作前應(yīng)按本文件4.3的要求提前準(zhǔn)備藥品器械，檢查沖卵管氣囊是否漏氣，沖胚液預(yù)熱到35℃~37℃。6.2對(duì)供體鹿進(jìn)行麻醉保定后運(yùn)回采胚室，放于保定架上，呈前低后高呈仰臥保定姿勢(shì)。6.3胚胎采集宜采用手術(shù)法，操作步驟如下：a)術(shù)部備皮：術(shù)部位于腹部中線距乳房約4cm處，術(shù)前用刀片對(duì)術(shù)部進(jìn)行備皮，用溫水清洗，5%碘酊和75%酒精消毒；b)在腹部中線距乳房基部前4cm處做一切口，然后將兩側(cè)子宮角和輸卵管暴露，用腹腔鏡觀察左右卵巢上的黃體發(fā)生情況并記錄；c)在一側(cè)子宮角基部用止血鉗穿孔，插入沖胚管，由充氣管注入5mL～10mL空氣，使氣囊封阻子宮腔；在子宮角和輸卵管結(jié)合部的子宮角端插入套管針，拔出針芯，將裝有磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline;PBS)的50mL注射器接到套管針上然后注入35℃~37℃的PBS30mL～50mL,將胚胎從子宮角的上端沖出，由沖胚管的出液孔收集于培養(yǎng)皿中，放氣后d)按本文件6.3c)的操作沖取另一側(cè)子宮角的胚胎；e)沖胚完成后將子宮角放回體內(nèi)，并用0.9%的生理鹽水進(jìn)行沖洗，并注入2mL石蠟液以防止生殖道粘連，肌注PG0.2mg;f)縫合和消毒：左右子宮角創(chuàng)口各縫1針，腹膜和肌肉層連續(xù)縫合，皮膚結(jié)結(jié)縫合，用5%碘酊消毒。術(shù)后三天內(nèi)每天注射2次抗生素。7胚胎檢查及凍前處理7.1檢前處理用20G針頭的注射器吸20mL沖胚液從上向下沖洗集卵杯內(nèi)側(cè)的尼龍網(wǎng)4次～5次，清除杯中的泡沫后待檢。7.2.1將回收沖胚液的平皿放在35℃熱臺(tái)上，在10倍～20倍體視顯微鏡下，從上到下、從左到右或從外到內(nèi)Z字形移動(dòng)，用吸胚管將找到的胚胎移入培養(yǎng)皿中的保存液小滴中。7.2.2再將同一供體母鹿的胚胎從液滴中全部吸出移到新液滴，反復(fù)洗滌胚胎3次～5次。7.2.3然后將體視鏡放大至50倍以上，進(jìn)行胚胎質(zhì)量鑒定和分級(jí)。7.3胚胎等級(jí)鑒定7.3.1胚胎發(fā)育階段分類參見附錄C。7.3.2胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)參見附錄D。37.3.3胚胎等級(jí)達(dá)到A級(jí)、B級(jí)的可用于冷凍。7.4胚胎洗滌用于冷凍的胚胎應(yīng)用保存液洗滌5次，每次洗滌不少于200μL,每組清洗胚胎數(shù)不能超過10枚，每頭每批次清洗應(yīng)更換吸管，每次清洗胚胎帶入平皿中的液體量盡量少，以不超平皿總液量的1%為宜。8胚胎冷凍8.1乙二醇冷凍法8.1.1平衡：將胚胎放入1.5mol/L或1.8mol/L乙二醇冷凍保護(hù)液中，平衡10min。8.1.2裝管：平衡后應(yīng)迅速將胚胎裝入0.25mL細(xì)管，每支細(xì)管以裝1枚胚胎為宜，裝管宜采用三段式，順序應(yīng)按乙二醇液→氣泡→含有胚胎的乙二醇液→氣泡→乙二醇液進(jìn)行，裝管后用標(biāo)簽塞插入封口端進(jìn)行封口。質(zhì)量級(jí)別、數(shù)量等。8.1.4植冰：將冷凍儀的程序調(diào)到“0”程序時(shí)，等溫度達(dá)到-6℃或-7℃時(shí)，將胚胎放入冷凍儀平衡5min后，用經(jīng)液氮冷卻的鑷子夾住遠(yuǎn)離胚胎的細(xì)管封口端植冰。8.1.5冷凍：植冰后平衡10min,以0.3℃/min～0.5℃/min速率降溫，達(dá)到-32℃~-35℃時(shí)，平衡10min,把細(xì)管投入液氮中。8.2甘油冷凍法9貯存細(xì)管無破損，標(biāo)記清晰、完整、準(zhǔn)確后貯存，并進(jìn)行記錄，參見附錄E。4T/CAAA112—2023(資料性)冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品見表A.1。表A.1冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表序號(hào)器材藥品超數(shù)排卵1CIDRFSH2埋栓器麻醉、蘇醒藥3吹管/吹彈75%酒精4輸精槍0.9%生理鹽水5工作服、乳膠手套6紫外線消毒燈7恒溫水浴鍋8注射器沖胚9保定架Holding胚胎保護(hù)液子宮頸擴(kuò)張棒PG(氯前列烯醇)子宮頸粘液吸除器液體石蠟沖卵管抗生素集卵杯5%碘酊過濾器縫合針(線)手術(shù)刀(止血鉗)備毛刀片創(chuàng)巾腹腔鏡消毒噴壺曲別針檢胚體視顯微鏡培養(yǎng)皿吸胚管移液器胚胎冷凍胚胎冷凍儀1.5mol/L或1.8mol/L乙二醇冷凍保護(hù)液(自配)液氮罐1.4mol/L(10%)甘油冷凍保護(hù)液(自配)0.25mL細(xì)管細(xì)管棉塞指拇管油性號(hào)筆5(資料性)埋栓和取栓輸精時(shí)間第0d第9d第10d第11d第12d第13d試情輸精或50h、58h各處理埋栓第7次注射FSH時(shí)取栓注射FSH等量法晚：40IU早：40IU晚：40IU早：40IU晚：40IU早：40IU晚：40IU早：40IU遞減法早：50IU晚：45IU早：45IU晚：35IU早：35IU晚：30IU早：30IU6T/CAAA112—2023胚胎發(fā)育階段形態(tài)特征早期桑椹胚/EM含有16個(gè)細(xì)胞以上，卵裂球緊界限清晰，沒有形成致密細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶內(nèi)的50%～60%空間。致密桑椹胚/CM卵裂球進(jìn)一步分裂變小，緊縮為團(tuán)塊狀，看不清卵裂球界限，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶內(nèi)的60%～70%空間。早期囊胚/EB細(xì)胞團(tuán)中出現(xiàn)散在的囊腔，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶內(nèi)的70%～80%空間。囊胚/BL已經(jīng)分化的滋養(yǎng)層和內(nèi)部致密的、顏色發(fā)暗的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和囊胚腔明顯是主要特征。滋養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)比較容易區(qū)別。此時(shí)的胚胎細(xì)胞充滿整個(gè)透明帶內(nèi)。擴(kuò)張囊胚/EXB整個(gè)胚胎直徑增大，囊胚腔充分?jǐn)U張，與透明帶之間無間隙，透明帶變薄，大約是原來厚度的1/3。孵化囊胚/HB正處于孵化階段的胚胎透明帶破裂或胚胎細(xì)胞團(tuán)正在脫出或者已脫離透明帶。7(資料性)D.1胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)見表D.1。表D.1胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)等級(jí)特征A級(jí)胚胎發(fā)育階段與胚齡一致，透明帶光滑無缺陷，胚胎細(xì)胞團(tuán)形態(tài)完整，輪廓清晰，卵裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊、色澤和透明度適中，無游離細(xì)胞或很少，變性細(xì)胞比例少于10%。B級(jí)胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致，輪廓清晰，胚胎細(xì)胞團(tuán)形態(tài)較完整，卵裂球大小基本一致，色澤和細(xì)胞透明度良好，變性及游離細(xì)胞約占10%～30%。C級(jí)胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致，且胚胎細(xì)胞團(tuán)輪廓不清，色澤和透明度變暗，卵裂球較松散，游離，變性及游離細(xì)胞約占30%～50%。D級(jí)胚胎發(fā)育停