可溶性抗原的分離與純化

可溶性抗原的分離與純化1引言面對(duì)食品安全中出現(xiàn)的新問題和新挑戰(zhàn)，各國和各地區(qū)出現(xiàn)了很多關(guān)于食品安全管理和控制的新觀點(diǎn)新模式，為了滿足這些新觀點(diǎn)和新模式的要求，出現(xiàn)了很多與之相適應(yīng)的食品安全檢測技術(shù)和新方法，食品檢測技術(shù)很多，其中生物學(xué)檢測方法在其領(lǐng)域被廣泛的應(yīng)用，而在生物檢測方法中免疫學(xué)方法應(yīng)用較多，基本原理是利用抗體與抗原的特異性結(jié)合特性來實(shí)現(xiàn)食品中污染物檢測的方法。根據(jù)免疫學(xué)法的基本原理可知抗原的制備過程在此方法占據(jù)重要地位，抗原按照水溶性可分為不溶于水的顆?？乖涂扇苄阅z體抗原，其中可溶性膠體抗原種類很多，主要包括蛋白質(zhì)、多糖和細(xì)菌毒素等，這些物質(zhì)可以存在于胞外和胞內(nèi)，并且和其他的物質(zhì)混合在一起，因此必須采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行分離和純化，對(duì)于胞外抗原細(xì)胞只需要進(jìn)行收集然后分離和純化，而細(xì)胞內(nèi)抗原則需要先將細(xì)胞破碎后再進(jìn)行分離和純化。以蛋白質(zhì)抗原為例分離純化敘述如下：2純化步驟2.1細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎的方法主要分為機(jī)械破碎和非機(jī)械破碎法，機(jī)械破碎法包括研磨法和超聲波破碎法，非機(jī)械破碎法包括酶溶法和化學(xué)滲透法。下面主要重點(diǎn)介紹一下超聲波破碎法。超聲波破碎法器原理是利用超聲波（10-20kHz）的機(jī)械振動(dòng)使細(xì)胞破碎，超聲波發(fā)生時(shí)的空化作用使得液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部發(fā)生流動(dòng)，漩渦形成和消失時(shí)，會(huì)產(chǎn)生很大的壓力從而使細(xì)胞破碎。同時(shí)超聲波振動(dòng)也可以引起細(xì)胞原生質(zhì)體內(nèi)部的漩渦運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生切變力促使細(xì)胞破碎。超聲波破碎法具體操作如下：將待破碎的細(xì)胞和蒸餾水或緩沖鹽按照一定比例混勻，這個(gè)比例需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來確定，太稀抗原有失活或變性的危險(xiǎn)。太稠則破碎效率偏低。另外加入巰基化合物作為保護(hù)劑，接通電源預(yù)熱10min，將超聲波發(fā)生器的探頭插入被處理的細(xì)胞懸浮液中，注意探頭不要接觸到器皿壁，然后進(jìn)行破碎。連續(xù)處理樣品時(shí)容易發(fā)生破壞抗原的情況，因此可至于冰域或每次停止1min以維持低溫狀態(tài)。最后將溶液過濾或離心，取上層清液即為含抗原的溶液。2.2細(xì)胞破碎程度的檢查檢查細(xì)胞破碎的程度有兩種方法，分別是測定釋放蛋白質(zhì)的含量和借助電鏡直接觀察和培養(yǎng)皿計(jì)算菌落的方法可以直觀的看到細(xì)胞的破碎情況。2.3蛋白質(zhì)抗原的初步分離和純化一般情況下，目的蛋白質(zhì)抗原含量都很低而且其中還混合著其他蛋白質(zhì)、核酸和多糖等雜質(zhì)，因此需要采用適當(dāng)?shù)姆椒ūM可能的除去其他雜質(zhì)，其方法有很多種應(yīng)用較多的有(NH4)2SO4鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和聚乙二醇沉淀法。2.3.1鹽析法蛋白質(zhì)是由氨基酸通過肽鏈連接形成的兩性多價(jià)電解質(zhì)。因此不同的蛋白質(zhì)將在不同的(NH4)2SO4濃度下從混合物中析出，從而達(dá)到分離純化的目的。此方法操作簡便，(NH4)2SO4價(jià)格便宜、溶解度大、對(duì)蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，可以除去大部分蛋白質(zhì)雜質(zhì)。2.3.2聚乙二醇法聚乙二醇是高分子多聚物，其沉淀蛋白質(zhì)的原理不是十分清楚，聚乙二醇法優(yōu)于鹽析法分段沉淀法，一次性可以處理大量的樣品，因此近些年來被廣泛采用，但是此沉淀法對(duì)小分子量的酶蛋白質(zhì)效果較差。2.3.3有機(jī)沉淀法在蛋白質(zhì)溶液中加入有機(jī)溶劑可以降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子電荷之間的相互作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度下降而析出。2.4蛋白質(zhì)抗原的進(jìn)一步分離純化經(jīng)過蛋白質(zhì)抗原的初步分離和純化大部分雜質(zhì)已經(jīng)被去除，經(jīng)過適當(dāng)?shù)耐肝龊蜐饪s后，有的可以直接用作免疫抗原，但是如果要研究抗分析原蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)或者抗原決定簇的的組成和結(jié)構(gòu)等則需要進(jìn)一步分離和純化，其方法主要采用色譜法，種類有離子色譜法、凝膠色譜法、吸附色譜法、親和色譜法、高效液相色譜法以及近十幾年才出現(xiàn)的徑向色譜和電泳技術(shù)等。2.5本公司可提供的儀器2.5.1超聲波細(xì)胞破碎儀超聲波細(xì)胞破碎儀我公司生產(chǎn)的HUP系列超聲波細(xì)胞破碎儀可以使兩種（或兩鐘以上）不相溶液體混合均勻。因而能達(dá)到一般的機(jī)械攪拌或搗碎所達(dá)不到的效果。主要特點(diǎn)：

1．可儲(chǔ)存5個(gè)控制模式。

2．定時(shí)數(shù)字顯示，輸出能量由光條顯示，0～100%連續(xù)可調(diào)，操作直觀方便。

3．工作方式有間斷（占空比由1%～100%可調(diào)）和連續(xù)兩種選擇，間斷工作時(shí)，脈沖寬度和間斷時(shí)間可分別設(shè)定。

4．工作時(shí)間可由數(shù)字定時(shí)器控制，達(dá)到預(yù)定時(shí)間自動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇龣C(jī)狀態(tài)，定時(shí)范圍1min～99min。

5.手持式超聲波細(xì)胞破碎儀可人為自由控制工作和截止時(shí)間，使用靈活方便，適用于少量樣品的處理工作。2.5.2菌落計(jì)數(shù)器菌落計(jì)數(shù)我公司生產(chǎn)的HCC系列菌落計(jì)數(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：1.半自動(dòng)點(diǎn)擊式計(jì)數(shù)。2.可選擇明暗視野背景。3.內(nèi)置平均數(shù)計(jì)算系統(tǒng)。