《高粱屬品種鑒定 InDel分子標記法（征求意見稿）》編制說明

地方標準編制說明一、目的意義簡述產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，制定標準的必要性、可行性，預(yù)期經(jīng)濟社會效益分析等。植迅猛發(fā)展。高粱種植面積在2015-2021年間增幅58.86%，年均復(fù)合增長率約江蘇作為我國釀酒產(chǎn)業(yè)強省之一，對高粱需求量大、品質(zhì)要求高。江蘇省相較于SSR分子標記，InDel標記分辨率和精準度更高、鑒定周期更短。SSR（Simplesequencerepeats）作為基因組遺傳特征并廣泛用于遺傳多樣性分析，而SSR分子標記法仍存在片段差異小、優(yōu)勢在于：1).與目標基因功能關(guān)聯(lián)，更利于分子輔助篩選和鑒定；2).可篩選片段差異大于50bp，便于分離和精準鑒定；3).分離方式可使用最常見的瓊脂糖電原料分子鑒定技術(shù)規(guī)程，而SSR分子標記法分辨率低、分析周期長的缺點一定分子標記，為我省高粱屬品種分子鑒定及品種權(quán)保護提現(xiàn)代分子遺傳研究方法可直接比對出基因InDels。2021年權(quán)威期刊Nature色體的yellowseed1基因編碼的MYB轉(zhuǎn)錄因子中存在大片段插入，造成不同高粱種質(zhì)內(nèi)外種皮顏色顯著變異。因此，依據(jù)泛基因組分析設(shè)計重要性狀的InDel1.制定高粱屬的InDel分子標記品種鑒定方法，將更加有效地保護育種者bigdataNew/home/ManageOrg當(dāng)前高粱品種活躍。高粱屬InDel分子標記品種鑒定方法將為品種DUS測試過程中的近似品種篩選、特異性輔助判定提供快速手段。2.制定高粱屬的InDel分子標記品種鑒定方法，將為規(guī)范高粱屬種業(yè)市場3.制定高粱屬的InDel分子標記品種鑒定方法，將為高粱實質(zhì)性派生品種基因型或者基因型組合產(chǎn)生的基本性狀方面與原始品種相同。InDe種鑒定方法可為快速分析遺傳親緣關(guān)系，利二、任務(wù)來源說明項目來源文件。本標準研制任務(wù)由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出，根據(jù)《省市場監(jiān)管局關(guān)于下達三、編制過程按時間節(jié)點或工作進度簡述編制過程。對已發(fā)表的13個參考基因組進行大片段比對并篩選片段>25bp的高性缺失位點，并依據(jù)染色體物體圖譜均勻分布的篩選原則，共計獲得有效InDel對276份高粱屬種質(zhì)DNA等份混合獲得12個基因池，篩選560個InDel行分析，獲得遺傳多樣性矩陣。進行聚類等差異分析后發(fā)現(xiàn)，可完全區(qū)別276依據(jù)高粱屬Harlen&Wet的Bicolor/Caudatum/Durra/Guinea/Kafir分類法，蘇地方種和蘇丹草2098。對以上60對核心InDel引物的6個代表性種質(zhì)PCR擴機構(gòu)等方面20位高級職稱專家意見，共收到100條，采納58條，部分采納8四、主要內(nèi)容技術(shù)指標確立簡述標準主要內(nèi)容技術(shù)指標確定的依據(jù)，包括實地調(diào)研、查閱資料、試驗論證等。標記法總則》標準編寫要求，采用以下原則編寫《高粱屬品種鑒定InDel分子規(guī)范性原則：本標準的制定符合法律法規(guī)，符合有關(guān)標準要求，包括GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、GB/T組二態(tài)性、大片段、高頻InDel位點并開發(fā)InDel標記，熒光毛細管電泳的高粱屬鑒定技術(shù)，證明采用InDel標記技術(shù)檢測高粱屬品種真法簡便、時間短、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析簡單、易實現(xiàn)數(shù)據(jù)（二）標準主要內(nèi)容因高粱種子粉末內(nèi)淀粉和蛋白質(zhì)含量過高，常規(guī)的CTAB法提取后的DNA圖1CTAB法和SDS法提取高粱種子DNA后的電泳比較。利用已發(fā)表13個高粱屬不同種質(zhì)基因組序列與高粱測序品種BT×623參考基因組序列進行比對。利用軟件MUMmer進行大片段同源序列比對篩選目標區(qū)本標準自主開發(fā)了一種快速預(yù)測Indel標記最小等位基因頻率的方法，混池樣品，再分別對N個混池DNA進行特異引物的PCR，所得N個產(chǎn)物二次條帶強弱進行量化分析后，計算MAF（%）=Intensity(弱帶)/[Intensity(弱圖2高粱屬Indel標記MAF預(yù)測流程。利用篩選出的111對高頻InDel引物對276份高粱種質(zhì)DNA進行逐一分析，依據(jù)其二態(tài)性獲得遺傳多樣性矩陣，并利用Neighbor-joining(NJ)聚類法構(gòu)建系統(tǒng)SS物的區(qū)分力足以辨別276份高粱屬種質(zhì)，特認定為核心引物，編號WS01-60。此外，將核心60對引物數(shù)量將至30個后的高粱屬種質(zhì)遺傳多樣性矩陣進一步構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3-C所示，出現(xiàn)了除JS172VSJS172_2對照外的大量種質(zhì)重復(fù)，說明縮減60對核心降低了種質(zhì)區(qū)分力。分別對以上60對引物的擴增產(chǎn)物進行Sanger雙向測序后并BLAST高粱屬測序品種BT×623參考基因組，確認其擴增序列染色體物理位置與設(shè)計位置相符。>2，判定為“不同”。圖3高粱屬276份種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹對比。 —0 5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 7580Chr.01STARTWS01WS02WS03WS04WS05WS06EndChr.02STARTWS07WS08WS09WS10WS11WS12EndChr.03Chr.04STARTWS19WS20WS21WS22WS23WS24EndChr.05STARTWS25WS26WS27WS28WS29WS30EndChr.06STARTWS31WS32WS33WS34WS35WS36EndChr.07STARTWS37WS38WS39WS40WS41WS42EndChr.08Chr.09Chr.10STARTWS55WS56WS57WS58WS59WS60EndSTARTWS13WS14WS15WS16WS17WS18EndSTARTWS43WS44WS45WS46WS47WS48EndSTARTWS49STARTWS13WS14WS15WS16WS17WS18EndSTARTWS43WS44WS45WS46WS47WS48EndSTARTWS49WS50WS51WS52WS53WS54End對核心引物的熒光毛細管電泳單峰比較如7所示，所得PCR產(chǎn)物大小與Sanger圖5高粱屬60對核心Indel標記的瓊脂糖電泳條帶圖。圖6高粱屬Indel標記毛細管熒光電泳全譜比較。圖7高粱屬60對核心Indel標記的毛細管熒光電泳單峰比較。表1高粱屬60對核心Indel標記遺傳多態(tài)性。引物名稱染色體位置參照品種InDel位點多態(tài)性（bp）MAF(%)BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草/b蘇牧3號1WS011a115043.11WS021241428428428428a42826.11WS031778778529529529a77827.51WS041816816816816816b3282.81WS051477477477a115335.92WS061301301259301301a3011WS072351296296296296a29625.01WS082283496283496496a49633.31WS092a13228.61WS102243243243590590a24339.51WS112277501277501/a27748.91WS122814814814515515a81423.91WS133278278355355355a3551WS143689418689418689ac418/68946.31WS153257529529257529a25732.61WS163567a1952WS173426a114140.02WS183959959644959959a95949.32WS194209a20944.91WS204a15827.51WS214302302302219219a30240.21WS224539310310310310a53930.81WS234435435a43529.31WS244263486486486486a48629.72WS255406a1901WS265a12326.11WS275264362362264362a26443.52WS285a8791WS295531531531a1701WS305211247211247247a21142.01WS316500500500500a1491WS326491658658658658a65825.71WS336257257257502502a25743.81WS346597362362362362a3621WS356a12823.61WS366498a1531WS377885885885a15637.31WS387298298485298298a2988.71WS3971005a1561WS407300300300300300a3486.91WS417396396396335335a33549.31WS427225225458225225a22521.01WS438422422a18449.32WS448a25638.81WS458373373373a37327.51WS468418418418a17244.61WS478416416a4161WS488833833599599599a5991WS499353353353a35340.61WS509a1831WS519435435435435435a1985.41WS529428660428428660a42847.52WS539a16248.21WS549207553207207207a55326.81WS5510361036373373373a103626.81WS56235235235481235a23544.31WS57644644644976976a64445.81WS58686868a117627.11WS59332332332332565a33237.31WS60423423423304423a42342.0總計29.21