胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展及其應(yīng)用教學(xué)教程

胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展及其應(yīng)用

胚胎干細(xì)胞（Embryonicstemcells，ES細(xì)胞）是一種從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Innercellmass，ICM）或原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells，PGCs）經(jīng)體外分化、抑制培養(yǎng)、分離和克隆得到的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。目前，ES細(xì)胞已經(jīng)引起廣大學(xué)者的注意和興趣，對(duì)ES細(xì)胞的研究也取得了很大進(jìn)展。

1.ES細(xì)胞的研究概況

ES細(xì)胞研究，首先源于畸胎瘤細(xì)胞（Teratocarcinomastemcell）或胚胎瘤細(xì)胞（Embryoniccarcinomacell，ES細(xì)胞）。1958年，Steven通過(guò)把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或腎臟被膜下得到了EC細(xì)胞[1]。隨后，EC細(xì)胞常被用以研究哺乳類(lèi)動(dòng)物發(fā)育和遺傳以及細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)各種誘導(dǎo)因子和實(shí)驗(yàn)條件，成功地誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和上皮細(xì)胞等包括三個(gè)胚層在內(nèi)的各種類(lèi)型的分化細(xì)胞。1974年，Brinster把EC細(xì)胞注射到胚泡腔后，EC細(xì)胞參與受體胚胎的發(fā)育，從而得到了嵌合體。1981年，Mintz等培養(yǎng)的METT-1系EC細(xì)胞具有與生殖腺嵌合的能力[2]。但是由于EC細(xì)胞種系間的嵌合率低，僅有13%，而且EC細(xì)胞具有腫瘤源性，生成的嵌合體到了成年又出現(xiàn)腫瘤，建成的EC細(xì)胞系有異常核型。因此EC細(xì)胞作為研究正常細(xì)胞分化的模型并不理想。

1981年，Evans和Kaufman首先在EC細(xì)胞研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)延遲著床的小鼠早期胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，首次分離得到小鼠ES細(xì)胞，并以?xún)蓚€(gè)人名字的開(kāi)頭字母命名為EK細(xì)胞，并建立了ES細(xì)胞系[3]。隨后，人們相繼建立了其它動(dòng)物的類(lèi)ES細(xì)胞。Doetschman(1988)、Piedrahita(1990)建立了倉(cāng)鼠的ES細(xì)胞系。Notarianni(1990)、Piedrakita(1990)、Strojek(1990)、Anderson(1990)和Wheeler(1994)各自成功的建立了豬的類(lèi)ES細(xì)胞系；Sukoyan(1992)建立了水貂的類(lèi)ES細(xì)胞系。Saito(1992)、Strelchenko(1994)和Stice(1993)建立了牛的類(lèi)ES細(xì)胞系，Sims(1993)對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行核移植，得到四頭犢牛，Cibelli用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了生殖系嵌合體牛。Craves(1993)、Niemann(1994)建立了兔的類(lèi)ES細(xì)胞系。Tsuchiya(1994)、Meinecke、Tillmann(1996)建立了綿羊ES細(xì)胞系，Campbel于1996年對(duì)綿羊ES細(xì)胞系進(jìn)行核移植，得到了四只羔羊。Bongso(1994)、Meineke-Tillmann(1996)建立了山羊的類(lèi)細(xì)胞系。1994年，Bonso建立了人的類(lèi)ES細(xì)胞系，1998年，Tillhomoson等建立了人的類(lèi)ES細(xì)胞系，并進(jìn)行了鑒定，其中，H9株傳32代，并能成功地進(jìn)行冷凍和解凍。該細(xì)胞的核型正常，AKP、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-18染色均為陽(yáng)性，體內(nèi)體外分化試驗(yàn)證明具有多能性[4]。

我國(guó)尚克剛（1989，1993，1994），叢笑倩（1990）也分別建立了小鼠的ES細(xì)胞系，并得到了嵌合體小鼠。1991年，陳立人建立了小鼠和豬的類(lèi)ES細(xì)胞系。1995年，賴(lài)學(xué)良建立了兔的ES細(xì)胞系，并得到了一只皮毛嵌合體小鼠。1999年，張學(xué)明對(duì)利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制作飼養(yǎng)層進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了2日齡到13日齡之間的小鼠胚胎最適于分離小鼠原代胚胎成纖維細(xì)胞[5]

西北農(nóng)業(yè)大學(xué)，從1994年開(kāi)始，用早期胚胎相繼分離克隆出的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳五代（1995，1997，1999）；牛的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳六代（1995，1998，1999）；小鼠的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳九代；1997年用分離流產(chǎn)胎兒原始生殖細(xì)胞克隆出人的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳六代；1999年分離克隆出牛的類(lèi)ES細(xì)胞，傳15代，并進(jìn)行了冷凍保存[6]。特別是近幾年來(lái)，由于對(duì)人的類(lèi)ES細(xì)胞的研究取得了很大進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外掀起了一股ES細(xì)胞的研究熱潮。

2.ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及基本特征2.1ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

ES細(xì)胞核大，胞質(zhì)胞漿少，細(xì)胞界限不明顯。體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長(zhǎng)，邊緣折光性強(qiáng)，集落邊緣可見(jiàn)有少量的已經(jīng)分化為扁平上皮細(xì)胞或梭形的成纖維細(xì)胞。用堿性磷酸酶染色法染色，ES細(xì)胞呈棕紅色，而周?chē)某衫w維細(xì)胞則呈淡黃色[7]。小鼠胚胎干細(xì)胞的直徑在7-18um之間，豬、牛和羊的ES細(xì)胞顏色較深，直徑為12-18um[8]?？偟膩?lái)說(shuō)，ES細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征。2.2ES細(xì)胞的基本特征

2.2.1全能性

ES細(xì)胞的全能性（totipotenty），是指ES細(xì)胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細(xì)胞發(fā)育成完整動(dòng)物體的能力。其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞基因組中決定蛋白質(zhì)編碼的所有基因按一定的時(shí)空順序依此表達(dá)。ES細(xì)胞是能在體外大量增殖的全能性細(xì)胞，可以為細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞分化研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料。ES細(xì)胞全能性的檢測(cè)方法是以胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植。如果ES細(xì)胞能和去核的細(xì)胞融合發(fā)育成重構(gòu)胚，而且經(jīng)過(guò)胚胎移植，重構(gòu)胚能發(fā)育形成個(gè)體，則表明ES細(xì)胞具有全能性。例如，Campkell將綿羊的類(lèi)ES細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞中，獲得重構(gòu)。重構(gòu)胚經(jīng)過(guò)胚胎移植，有活的羔羊產(chǎn)生，證明了綿羊的類(lèi)ES細(xì)胞具有發(fā)育全能性[9]。2.2.2多能性

多能性（Pluripotency）是指ES細(xì)胞具有發(fā)育成多種組織的能力，參與部分組織的形成。細(xì)胞多能性檢測(cè)的方法很多，主要有：1.體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化試驗(yàn)將ES細(xì)胞培養(yǎng)在不含分化抑制物的培養(yǎng)基上，可以形成類(lèi)胚體（Embryoidbodies）。2.將ES細(xì)胞在特定培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，定向分化成特定組織。例如，在含有白血病抑制因子（LIF）和維生素A酸（RA）的培養(yǎng)基可以分化形成體壁內(nèi)胚層。3.將ES細(xì)胞懸液（1-2×107個(gè)/ml）注射入同原動(dòng)物皮下，形成組織瘤，可以形成內(nèi)胚層，中胚層，外胚層。4.胚胎嵌合法，將ES細(xì)胞與胚胎細(xì)胞共同培養(yǎng)或者將ES細(xì)胞注射入囊胚腔中，ES細(xì)胞就會(huì)參與多種組織發(fā)育。如Kaufman首次用小鼠ES與囊胚嵌合，獲得了第一個(gè)生殖腺嵌合體小鼠，表明ES細(xì)胞具有發(fā)育多能性。

利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞或其條件培養(yǎng)液，可誘導(dǎo)ES細(xì)胞在體外分化為造血干細(xì)胞（transforminggrowthfactorB，TGF-B）的ES細(xì)胞，在維甲酸（RA）培養(yǎng)液經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成抑胚體，再繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，可見(jiàn)擬胚體周?chē)性S多由內(nèi)皮細(xì)胞排列而成的輻射狀血管樣結(jié)構(gòu)；ES細(xì)胞在RA與雙丁酰基環(huán)腺苷磷酸（dibutyrylcyclicadenosinemonohosphatedBcAmp）共同作用下，可以分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；在RA誘導(dǎo)下，ES細(xì)胞可分化為肌細(xì)胞；ES或EG細(xì)胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成的擬胚體在二甲基亞砜（DMSO）、胰島素，三碘腺原氨酸（triiodofhgronine）、胎牛血清或維甲酸（RA）的共同作用下可分化為脂肪細(xì)胞；ROSAB-geo基因傳染的ES細(xì)胞在缺乏G418、含有10%小牛血清，1umol/L低塞米松（dexamethason）條件下可以分化成軟骨細(xì)胞[10]。

此外，也可以通過(guò)測(cè)定時(shí)期專(zhuān)一性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigenSSEA）.堿性磷酸酶（AKP）、OCT-4基因、端粒酶（telomerase）等發(fā)育全能性標(biāo)志來(lái)確定。ES細(xì)胞表達(dá)SSEA，因此常用單克隆抗體SSEA-1檢測(cè)ES和EG細(xì)胞表面抗原作為發(fā)育全能性的標(biāo)志。ES和EG等未分化干細(xì)胞具有較AKP高的活性。而在已分化的細(xì)胞中，活性則明顯降低。OCT-4是一種發(fā)育全能性的標(biāo)志基因，在小鼠胚胎發(fā)育早期，生殖細(xì)胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞都能特異性的表達(dá)OCT-4基因，而分化細(xì)胞則無(wú)OCT-4基因表達(dá)。端粒酶是一類(lèi)核糖糖蛋白，與維持真核細(xì)胞染色體末端的端粒長(zhǎng)度以及控制細(xì)胞壽命有關(guān)。人ES細(xì)胞端?；钚院芨?，而分化細(xì)胞則一般難以檢測(cè)到其活性[11]。

3.ES細(xì)胞系的建立概況及建系的技術(shù)要點(diǎn)：3.1ES細(xì)胞系的建立概況

迄今為止，小鼠與人的ES細(xì)胞系已經(jīng)成功建立，其他動(dòng)物如倉(cāng)鼠、豬、牛、水貂、兔、山羊的類(lèi)ES細(xì)胞系也相繼建立，在牛、兔上還得到了轉(zhuǎn)基因嵌合體動(dòng)物[12]。

3.2ES細(xì)胞建系的技術(shù)要點(diǎn)

ES細(xì)胞建系的原理是將早期胚胎（桑椹胚或囊胚）或者是用外科手術(shù)法得到的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Innercellmass，ICM）或者原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells，PGCs）與分化抑制物共同培養(yǎng)，使之增值而又保持未分化狀態(tài)，這樣代代相傳，從而使數(shù)量有限的胚胎或者PGCs細(xì)胞能夠成千上萬(wàn)倍地克隆。其建系的基本技術(shù)要點(diǎn)如下：

3.2.1飼養(yǎng)層的制備及分化抑制物的選擇

常用的飼養(yǎng)層是由小鼠成纖維細(xì)胞無(wú)限系（STO）或小鼠原始胚胎成纖維細(xì)胞（PMEF）制備而成，STO或PMEF經(jīng)過(guò)絲裂霉素C等有絲分裂抑制劑處理后，與早期胚胎或PGCs共同培養(yǎng)后，ES細(xì)胞就可以分離出來(lái)了。STO和PMEF細(xì)胞可以分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF（fibroblastgrowthfactor）、分化抑制因子LIF(leukemiainhibitoryfactor)，這些因子有助于ES細(xì)胞增值，而且能抑制細(xì)胞的凋亡和分化。此外，也可以用綿羊、山羊的輸卵管或子宮上皮、牛的顆粒細(xì)胞、子宮成纖維細(xì)胞等作為分化抑制培養(yǎng)基[13]。3.2.2早期胚胎及PGCs的選擇和分離

以下早期胚胎都可以作為建立胚胎干細(xì)胞系的材料：小鼠的桑椹胚（2日齡），囊胚（3日齡）和延遲囊胚（4-6日齡）；豬的囊胚（7-10日齡）；綿羊的囊胚（7-9日齡）；山羊的囊胚（7-8日齡）；牛的桑椹胚（6-7日齡），囊胚（7-8）日齡；兔的囊胚（4-5日齡）；水貂的囊胚（8-10日齡）；倉(cāng)鼠的囊胚（3日齡）。3.2.3早期胚胎及PGCS的培養(yǎng)和ES細(xì)胞的分離傳代

將早期胚胎或PGCs置于飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上，在5%CO2、37~39℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液一般為DMEM+15%胎牛血清（FCS）。培養(yǎng)液中可添加多種細(xì)胞因子或分化抑制物，如分化抑制因子（LIF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、β—硫基乙醇（mercaptoethanol）等。

進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM增殖后或PGCS出現(xiàn)ES樣克隆后即可傳代。ES細(xì)胞的增殖速度很快，小鼠ES細(xì)胞每7-8小時(shí)倍增一次，豬類(lèi)ES細(xì)胞每20小時(shí)倍增一次，羊類(lèi)ES細(xì)胞，每40-50小時(shí)倍增一次，牛類(lèi)ES細(xì)胞每18-24小時(shí)倍增一次14。傳代時(shí)一般是用胰酶EDTA消化，在用微吸管或撥針將其打散成單個(gè)細(xì)胞，然后移入新的飼養(yǎng)層上，進(jìn)行培養(yǎng)幾天后，即可出現(xiàn)新的克隆點(diǎn)，在其分化之前可以再進(jìn)行傳代。3.2.4ES細(xì)胞的鑒定及保存

ES細(xì)胞的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定，堿性磷酸酶（AKP）染色，表面抗原檢測(cè)，核型分析，體外分化實(shí)驗(yàn)，嵌合體實(shí)驗(yàn)，核移植等。

ES細(xì)胞保存方法一般是冷凍保存，比早期胚胎的凍存技術(shù)要簡(jiǎn)單一些。冷凍保護(hù)液一般為DAEM+30%-50%NBCS（新建牛血清）+10%DMSO（二甲基亞砜）。冷凍過(guò)程為：室溫下平衡10分鐘→10℃冰箱3-5小時(shí)→-7℃冰箱過(guò)夜→第二天放入液氮中長(zhǎng)期保存，也可以-70℃冰箱保存幾個(gè)月。解凍一般在37℃水浴中進(jìn)行，解凍后立即用新的培養(yǎng)液替換冷凍保護(hù)液，隨后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4.ES細(xì)胞的應(yīng)用及前景ES細(xì)胞特有的生物學(xué)特性,決定了其在生物學(xué)領(lǐng)域有著不可估量的應(yīng)用價(jià)值.在進(jìn)行ES細(xì)胞建系和定向分化的同時(shí),在核移植,嵌合體,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究等方面也進(jìn)行了廣泛的嘗試,已經(jīng)充分體現(xiàn)出ES細(xì)胞在加快良種家畜繁育,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,哺乳動(dòng)物發(fā)育模型,基因和細(xì)胞治療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景.

4.1ES細(xì)胞與動(dòng)物克隆

ES細(xì)胞具有可以無(wú)限地傳代增殖，而且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點(diǎn)。如果以ES細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植,可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個(gè)體。而且用ES細(xì)胞與胚胎進(jìn)行嵌合克隆動(dòng)物,可以解決哺乳動(dòng)物遠(yuǎn)緣雜交的困難,生產(chǎn)出珍貴的動(dòng)物,也可以進(jìn)行異種動(dòng)物克隆,有助于保護(hù)珍惜野生動(dòng)物.自綿羊“多莉”出世后，許多科學(xué)家對(duì)體細(xì)胞克隆進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，并取得了成功。但是，盡管體細(xì)胞克隆與ES細(xì)胞克隆相比有著易于取材的特點(diǎn)，但是體細(xì)胞克隆也存在著不少缺點(diǎn)，如生理和免疫缺陷，目前體細(xì)胞克隆還不能完全代替ES細(xì)胞克隆。4.2基因載體

目前常用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是向受精卵中注射DNA，外源基因的整合、表達(dá)和篩選工作是在個(gè)體水平上進(jìn)行的，不僅工作繁瑣，周期長(zhǎng)成功率低，產(chǎn)生的后代的遺傳性狀也常出現(xiàn)分離；而利用ES細(xì)胞作為基因載體，得到基因整合的細(xì)胞，將載體ES細(xì)胞直接進(jìn)行核移植或者通過(guò)與胚胎嵌合獲得嵌合動(dòng)物，ES細(xì)胞在嵌合體中分化發(fā)育