華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

ICSFORMTEXT65.150FORMTEXTB51FORMTEXT備案號(hào)：DB4405006502-2017DB44DB440500/T272—2017FORMTEXT華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)FORMTEXTNobleScallop“NanaoGoldenScallop”Germplasm修訂（送審稿）2017-02-20發(fā)布2017-02-01實(shí)施汕頭市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB440500/T272—2017前??言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定進(jìn)行編寫。本標(biāo)準(zhǔn)與DB440500/T272—2017相比，除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下：——修改了規(guī)范性引用文件；——修改了“掃描儀”內(nèi)容；本標(biāo)準(zhǔn)的制定由汕頭大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)制定單位：汕頭大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要制定人：鄭懷平、劉合露、張洪寬、周文川、張博、張倩、王亞駿、郭治誠(chéng)本標(biāo)準(zhǔn)2017年發(fā)布，本次為第一次修訂。華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了華貴櫛孔扇貝[Chlamysnobilis]“南澳金貝”的主要生物學(xué)性狀、生長(zhǎng)與繁殖、遺傳學(xué)特性、及檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”的種質(zhì)檢測(cè)與鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18654.1-2008養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第1部分：檢驗(yàn)規(guī)則 GB/T18654.2-2008養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法 GB/T18654.12-2008養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第12部分：染色體組型分析GB/T18654.13-2008養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第13部分：同工酶電泳分析GB/T21442-2008櫛孔扇貝種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”“GoldenScallop”Chlamysnobilis外觀色澤金黃，肌肉組織也呈金黃色的華貴櫛孔扇貝。分類位置軟體動(dòng)物門（Mollusca），雙殼綱（Bivalvia），翼形亞綱（Pterimorphia），珍珠貝目(Pterioidae)，扇貝科(Pectinidae)，櫛孔扇貝屬（Chlamys）。文件的類別按照標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)象將本標(biāo)準(zhǔn)劃分為：過程標(biāo)準(zhǔn)。主要形態(tài)結(jié)構(gòu)特征外部形態(tài)特征外形華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”兩枚貝殼外表均為金黃色（圖1），貝殼大，近圓形，殼長(zhǎng)略小于殼高。左殼較凸，右殼較平。兩耳不相等，前耳大，后耳小。殼表具大而等粗的放射肋23條左右，肋上具有翹起的小鱗片。足絲孔具細(xì)齒。鉸合線直。圖1華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”外形可數(shù)性狀櫛孔齒數(shù)目：6～10左殼的放射肋數(shù)目：23右殼的放射肋數(shù)目：23可量性狀殼長(zhǎng)5.94～7.78cm的華貴櫛孔扇貝可量性狀及比值見表1。華貴櫛孔扇貝可量性狀及比值性狀（比值）殼長(zhǎng)(cm)殼高(cm)殼寬(cm)體重(g)殼長(zhǎng)/殼寬殼長(zhǎng)/殼高殼寬/殼高平均值7.117.612.3242.863.070.9340.305標(biāo)準(zhǔn)差±0.405±0.389±0.122±5.58±0.173±0.041±0.019內(nèi)部特征雌雄異體，成熟個(gè)體的雄性生殖腺為乳白色、雌性生殖腺為金黃色（圖2）；外套膜為金黃色、緊貼殼緣，外套眼明顯；鰓為新月形，左右各一瓣，位于外套膜的內(nèi)側(cè)。貝殼內(nèi)面有與殼面相對(duì)應(yīng)的肋與溝；無(wú)前閉殼肌、僅有后閉殼肌，閉殼肌粗大可分為明顯的橫紋?。ń瘘S色）和平滑?。ò咨﹥刹糠?。圖2華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”內(nèi)部形態(tài)生態(tài)特征食性以慮食浮游植物和有機(jī)碎屑為主的雜食性。適宜水溫適應(yīng)生長(zhǎng)溫度12℃～32℃，最適水溫20℃～25℃。生長(zhǎng)與繁殖生長(zhǎng)華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”3、4月培育的春季苗種，次年3、4月即可達(dá)到商品規(guī)格，可以留做親貝；10、11月培育的秋季苗種，次年10、11月也可達(dá)到商品規(guī)格，可以留做親貝。華貴櫛孔扇貝在自然條件下殼長(zhǎng)（L）與體重（W）關(guān)系式見式⑴： (SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)公式\*ARABIC1)式中：W——華貴櫛孔扇貝殼長(zhǎng)L時(shí)的體重，單位為克（g）；L——華貴櫛孔扇貝體重W時(shí)的殼長(zhǎng)，單位為厘米（cm）。繁殖性成熟年齡性成熟年齡為1齡。性別一般為雌雄異體。繁殖期每年5月～6月及9月～10月為繁殖盛期。懷卵量平均懷卵量為300萬(wàn)粒/只～1500萬(wàn)粒/只。生殖方式卵生型，分批產(chǎn)卵，體外受精。遺傳學(xué)特性細(xì)胞遺傳學(xué)特性染色體數(shù)體細(xì)胞染色體數(shù)：2n＝32。核型核型公式：6m+26t，染色體臂數(shù)(NF)=38，染色體組型圖見圖3。圖3華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”染色體組型圖生化遺傳學(xué)特征華貴櫛孔扇貝閉殼肌肉乳酸脫氫酶（LDH）同工酶電泳圖譜見圖4。圖4華貴櫛孔扇貝閉殼肌肉乳酸脫氫酶（LDH）同工酶電泳圖譜檢測(cè)方法抽樣方法按照GB/T18654.2執(zhí)行。生物學(xué)測(cè)定用游標(biāo)卡尺測(cè)量殼長(zhǎng)、殼高、殼寬等數(shù)值（具體測(cè)量方法如圖4），精確到0.1mm。電子天平稱量總重、軟體部重（濾紙盡量吸去水）和殼重，精確到0.1g殼長(zhǎng)（Shelllength,SL）:前后緣鱗片基部與絞合線平行的最大距離；殼高（Shellheight,SH）:從殼頂至腹緣鱗片基部與絞合線垂直的最大距離；殼寬（Shellwidth,SW）:捏緊兩邊貝殼使殼寬不再變小時(shí)測(cè)量其兩殼最大距離。染色體標(biāo)本的制備剪取小塊鰓組織，用海水洗凈，放入0.4g/L秋水仙素30min；用體積分?jǐn)?shù)為20%的人工海水低滲處理50min（或者用0.075mol/LKCl低滲處理30min）；卡諾氏液（V甲醇：V冰醋酸=3:1）固定約60min，中間換液4次；用體積分?jǐn)?shù)為50%的冰醋酸解離制成細(xì)胞懸液；50℃熱滴片；空氣干燥后用10%Giemsa染液（pH值6.8）染色20min（Giemsa染液配制見附錄A）；自來(lái)水沖洗，自然干燥后鏡檢。核型分析觀察100個(gè)左右的分裂相，選擇染色體分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)得出二倍體染色體條數(shù)。從中挑選10個(gè)分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相進(jìn)行顯微攝影、放大、測(cè)量，按Levan等確定的分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)染色體分類，統(tǒng)計(jì)處理測(cè)量數(shù)據(jù)，分析其特征。同工酶電泳分析樣品制備隨機(jī)取活樣20尾以上，取閉殼肌，放入離心管，加入0.1mol/L，磷酸緩沖液（見A.1）1000μL，冰浴條件下研磨，全部研磨后倒入離心管，12000r/min4℃離心20min，取上清液置于—20℃冰箱保存?zhèn)溆?。凝膠制備由7.5%分離膠和2.5%濃縮膠制成聚丙烯酰胺垂直板凝膠，各種凝膠制備溶液配方見表A.1，凝膠制備配方見表A.2。點(diǎn)樣與電泳在電泳槽中分別加入上、下槽電極緩沖液（見表A.3），取樣品上清液100μl，加50%甘油50μl和0.05%溴酚藍(lán)10μl，混合均勻后用微量注射器吸取8μl，注入點(diǎn)樣孔，置于4℃，220V條件下電泳，至溴酚藍(lán)指示劑到下槽玻璃下緣為止。染色、固定、掃描染色：將電泳膠放入預(yù)先準(zhǔn)備好的同工酶染色液（見表A.4）中，30℃恒溫條件下染色，30～45min直至得到清晰的酶帶止。固定：在2.5%的冰醋酸中褪色至底板清晰、透明。掃描：透明后即刻用凝膠成像掃描儀對(duì)固定的凝膠進(jìn)行掃描、保存。結(jié)果分析按GB/T18654.13的規(guī)定執(zhí)行。

（規(guī)范性附錄）

同工酶各種試劑的配制磷酸緩沖液（0.1mol/LpH7.2）的配制A液（0.1mol/L，Na2HPO4）配制：取17.80gNa2HPO4·2H2O或35.82gNa2HPO4·12H2O定容于1000mL純水中。B液（0.1mol/L，NaH2PO4）配制：取13.80gNaH2PO4·H2O或15.60gNaH2PO4·2H2O定容于1000mL蒸餾水中。磷酸緩沖液：由A液和B液按72:28的比例混合而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。凝膠制備凝膠制備溶液配制各種凝膠制備溶液配方見表A.1。各種凝膠制備溶液配方溶液配制方法分離膠緩沖液取Tris56.75g加200mL純水，用濃鹽酸調(diào)pH至8.9加純水到250mL。凝膠儲(chǔ)液取丙烯酰胺93.75g，N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺2.50g溶于純水中定容到250mL。AP取過硫酸銨17.5mg溶解到10mL純水中。TEMED（N，N，N，，N，-四甲基乙二胺）分裝。濃縮膠緩沖液取Tris5.98g加80mL純水，濃鹽酸調(diào)pH至6.7加純水到100mL。分離膠和濃縮膠的制備用7.5%分離膠和2.5%濃縮膠制成聚丙烯酰胺垂直板凝膠。凝膠制備配方見表A.2。凝膠制備配方7.5%分離膠2.5%濃縮膠分離膠緩沖液，mL0.600.63凝膠儲(chǔ)液，mL3.000.34AP，mL1.500.70TEMED，μl2420加純水至總體積，mL15.005.00電極緩沖液電極緩沖液制備溶液配制方法上槽電極緩沖液母液pH8.3（電泳時(shí)稀釋10倍）取Tris6.00g，甘氨酸28.80g，加純水定容到1000mL。下槽電極緩沖液母液（電泳時(shí)稀釋5倍）取Tris56.75g加200mL純水，用濃鹽酸調(diào)pH至8.9，加純水至250mL。同工酶染色液的配制先配制染色用各溶液見表A.4，再配制染色液見表A.5。染色用溶液配方溶液配制方法1.5mol/LTris-HCL染色緩沖液（pH9.5）取Tris181.75g溶于900mL純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9.5，再用純水稀釋到1000mL。氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）取250mgNBT溶于2