DB32T-甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程編制說(shuō)明

甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（送審稿）編制說(shuō)明《甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》編制組2024年8月一、目的意義1.產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀甘藍(lán)類(lèi)蔬菜作物種類(lèi)眾多，包括結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜、青花菜、芥藍(lán)、苤藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)等十余種變種類(lèi)型，在我國(guó)不同地域均有分布和種植。在諸多甘藍(lán)類(lèi)蔬菜中，結(jié)球甘藍(lán)的種植面積約為1400萬(wàn)畝，花椰菜和青花菜種植面積分別約為700萬(wàn)畝和130萬(wàn)畝，在全國(guó)蔬菜周年供應(yīng)及出口貿(mào)易中占有十分重要的地位。江蘇省是甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的重要產(chǎn)區(qū)，播種面積約為200萬(wàn)畝。隨著甘藍(lán)類(lèi)蔬菜栽培面積的逐步擴(kuò)大及復(fù)種指數(shù)的提高，由蕓薹生鏈格孢（Alternariabrassicicola）引起的黑斑病呈加重態(tài)勢(shì)。此外，黑斑病菌還能侵染角果，導(dǎo)致種子帶菌，從而影響制種產(chǎn)量和質(zhì)量。2.制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性目前生產(chǎn)上缺乏商業(yè)化的抗病品種，化學(xué)藥劑成為防治黑斑病的主要手段。黑斑病菌的準(zhǔn)確識(shí)別對(duì)于化學(xué)藥劑選擇和施藥時(shí)機(jī)把握具有重要生產(chǎn)意義。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinasepolymeraseamplification，RPA）是一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可在較低恒溫（37℃~42℃）條件下，通過(guò)重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、鏈置換DNA聚合酶的作用，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)區(qū)段的高效擴(kuò)增。本項(xiàng)目制定的甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程，旨在通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，及時(shí)掌握黑斑病的發(fā)生危害程度，提高黑斑病的防控意識(shí)和能力，對(duì)促進(jìn)江蘇省甘藍(lán)類(lèi)蔬菜產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有十分重要的意義。3.制定標(biāo)準(zhǔn)的可行性江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站在甘藍(lán)類(lèi)蔬菜病害綠色防控技術(shù)研發(fā)和推廣方面具有良好的合作基礎(chǔ)，在國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金等相關(guān)項(xiàng)目的資助下，在黑斑病病原的鑒定與分子檢測(cè)、抗病種質(zhì)資源篩選與利用等方面開(kāi)展了大量工作。本規(guī)程是在試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)查閱而提出，該技術(shù)規(guī)程可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)病原菌的特異靈敏檢測(cè)，助力黑斑病的長(zhǎng)效防控。二、任務(wù)來(lái)源2023年8月4日，江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布《關(guān)于下達(dá)2023年度江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（蘇市監(jiān)標(biāo)〔2023〕173號(hào)），下達(dá)2023年度343項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)制（修）訂項(xiàng)目，其中122號(hào)《甘藍(lán)類(lèi)蔬菜真菌性黑斑病快速檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)編制的任務(wù)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站共同負(fù)責(zé)起草制定。經(jīng)專(zhuān)家建議和進(jìn)一步的資料檢索，我們發(fā)現(xiàn)引起甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病的病原雖有細(xì)菌和真菌之分，但通常只將細(xì)菌引起的黑斑病稱(chēng)為細(xì)菌性黑斑病，而鏈格孢屬真菌引起的病害則仍稱(chēng)為黑斑病。因此在不改變范圍和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，我們對(duì)標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)進(jìn)行了適當(dāng)修改，更改后的標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)為“甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”。三、編制過(guò)程（1）成立編制組2023年8月，收到江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局《關(guān)于下達(dá)2023年度江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)劃的通知》文件后，立即成立標(biāo)準(zhǔn)起草小組，由余方偉擔(dān)任組長(zhǎng)，曾曉萍、李建斌、馬金俊、王神云、張偉、于利6位成員組成。（2）起草階段2023年8月，起草組系統(tǒng)查閱了十字花科蔬菜黑斑病的病原鑒定、發(fā)生規(guī)律、綜合防控和黑斑病菌分子檢測(cè)等有關(guān)的技術(shù)資料，對(duì)收集的資料進(jìn)行全面分析、比較，結(jié)合起草組承擔(dān)的各類(lèi)國(guó)家和省級(jí)項(xiàng)目在黑斑病病原分離、分子檢測(cè)等方面的研究成果，確定了標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)設(shè)置，并于2024年4月完成初稿，隨后召開(kāi)內(nèi)部討論會(huì)，根據(jù)討論會(huì)意見(jiàn)對(duì)文稿進(jìn)行進(jìn)一步修改完善，2024年5月形成了征求意見(jiàn)稿。（3）征求意見(jiàn)情況2024年5-8月，將征求意見(jiàn)稿發(fā)送至浙江大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院、北京市農(nóng)林科學(xué)院、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、西南大學(xué)、福建農(nóng)林大學(xué)、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院、宜興市蔬菜辦公室和江蘇中江種業(yè)股份有限公司等13家單位相關(guān)專(zhuān)家征求意見(jiàn)，共征集到來(lái)自11個(gè)單位11位專(zhuān)家的32條意見(jiàn)，起草小組根據(jù)專(zhuān)家意見(jiàn)進(jìn)行修改完善，最終形成了送審稿。四、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)的編寫(xiě)原則本標(biāo)準(zhǔn)遵循“科學(xué)、適度、可行”的原則，嚴(yán)格按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定進(jìn)行編寫(xiě)。在標(biāo)準(zhǔn)的征求意見(jiàn)稿和送審稿的編制過(guò)程中力求做到技術(shù)內(nèi)容的敘述正確無(wú)誤，文字表達(dá)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易懂，標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)成嚴(yán)謹(jǐn)合理，內(nèi)容編排符合邏輯。制定的標(biāo)準(zhǔn)力求切實(shí)可行，易于為相關(guān)從業(yè)者所掌握和使用。（二）標(biāo)準(zhǔn)的提出依據(jù)蕓薹生鏈格孢是引起甘藍(lán)類(lèi)屬蔬菜黑斑病的主要病原。目前，國(guó)內(nèi)尚未正式制定“甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”的國(guó)家或行業(yè)技術(shù)規(guī)程。標(biāo)準(zhǔn)起草小組為解決甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌的RPA檢測(cè)，前期開(kāi)展了該檢測(cè)技術(shù)的靶標(biāo)選擇、引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系優(yōu)化、室內(nèi)檢測(cè)的研究。最終，標(biāo)準(zhǔn)起草小組在結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索和現(xiàn)有試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，撰寫(xiě)了基于RPA的甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程。主要參考文獻(xiàn)如下：[1]劉煥然,柯桂蘭.十字花科蔬菜黑斑病原種群組成及季節(jié)變化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1992,1(4):6-10.[2]肖長(zhǎng)坤,李勇,李健強(qiáng).十字花科蔬菜種傳黑斑病研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,8(5):61-68.[3]李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜黑斑病識(shí)別與防治[J].當(dāng)代蔬菜,2004,(10):34-36.[4]文朝慧,李鐵夫,王軍平,劉箐,周?chē)?出口蘿卜種子中蕓薹生鏈格孢的分離與鑒定[J].植物檢疫,2007,21(1):4-6.[5]王漢榮,方麗,任海英,蘇英京.青花菜黑斑病的識(shí)別與防治[J].中國(guó)蔬菜,2010,(5):23-24.[6]王超,張曉烜,王寧寧.甘藍(lán)黑斑病病原菌鑒定[C]//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)十字花科蔬菜分會(huì).中國(guó)園藝學(xué)會(huì)十字花科蔬菜分會(huì)第十屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.2012:5.[7]王瑩瑩,宋加偉,石延霞,張揚(yáng),李寶聚.李寶聚博士診病手記（八十四）白菜黑斑病病原菌鑒定及防治方法[J].中國(guó)蔬菜,2015,(7):72-74.[8]ChoY.HowthenecrotrophicfungusAlternariabrassicicolakillsplantcellsremainsanenigma[J].EukaryoticCell,2015,14(4):335-344.[9]高威芳,朱鵬,黃海龍.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù):一種新的核酸擴(kuò)增策略[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2016,32(6):627-634.[10]付永文.西蘭花黑斑病重發(fā)原因與防控技術(shù)初探[J].中國(guó)農(nóng)技推廣,2016,32(12):47-49.[11]DonosoA,ValenzuelaS.In‐fieldmoleculardiagnosisofplantpathogens:recenttrendsandf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