高三一輪復(fù)習(xí)生物：基因工程和生物技術(shù)的安全與倫理問(wèn)題課件

第33課基因工程和生物技術(shù)的安全與倫理第十單元生物技術(shù)與工程學(xué)業(yè)質(zhì)量水平：1．結(jié)合生活或生產(chǎn)實(shí)例，舉例說(shuō)出基因工程的基本原理。結(jié)合生活或生產(chǎn)實(shí)例，舉例說(shuō)出日常生活中的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。(生命觀念)2．運(yùn)用比較、歸納與概括的方法，理解限制酶和DNA連接酶的作用特點(diǎn)；運(yùn)用結(jié)構(gòu)與功能觀，理解載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及作用。運(yùn)用批判性思維，對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中帶來(lái)的影響，表明自己的觀點(diǎn)并展開(kāi)討論。(生命觀念、科學(xué)思維)3．按照實(shí)驗(yàn)操作步驟，進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)，寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告并與他人進(jìn)行必要的交流。(科學(xué)思維、科學(xué)探究)4．運(yùn)用演繹與推理、模型與建模，理解基因工程基本操作程序，進(jìn)行簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)。(生命觀念、科學(xué)思維)5．按照實(shí)驗(yàn)操作步驟，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)。(科學(xué)思維、科學(xué)探究)6．結(jié)合生活或生產(chǎn)實(shí)例，舉例說(shuō)出基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程的基本原理，嘗試提出初步的蛋白質(zhì)工程學(xué)構(gòu)想，進(jìn)行簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)。(生命觀念、科學(xué)思維)7．運(yùn)用批判性思維分析生殖性克隆人面臨的倫理問(wèn)題和歷史上生物武器對(duì)人類(lèi)造成的嚴(yán)重的威脅與傷害。討論并對(duì)我國(guó)不接受任何生殖性克隆人實(shí)驗(yàn)和我國(guó)反對(duì)生物武器及其技術(shù)和設(shè)備的擴(kuò)散做出理性解釋?zhuān)囵B(yǎng)正確的人生態(tài)度和價(jià)值觀。(社會(huì)責(zé)任)課標(biāo)要點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具主干梳理1．基因工程分子基因重組構(gòu)建重組DNA分子表達(dá)產(chǎn)物2．重組DNA技術(shù)的基本工具細(xì)菌核苷酸磷酸二酯鍵黏性動(dòng)、植物病毒噬菌體復(fù)制起點(diǎn)限制酶的識(shí)別序列標(biāo)記外源DNA3．活動(dòng)：DNA的粗提取和鑒定(1)活動(dòng)原理①幼嫩的植物材料如果經(jīng)過(guò)________后再研磨，細(xì)胞結(jié)構(gòu)容易被破壞。②用____________________(SDS)處理材料，能使核蛋白________并與___________分離。③乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)能抑制_____________活性，防止核DNA被酶解。④DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度______，且Na＋與DNA形成鈉鹽。冷凍十二烷基硫酸鈉變性DNADNA酶高⑤DNA鈉鹽不溶于________而某些蛋白質(zhì)能溶于________。⑥在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成________。(2)活動(dòng)步驟酒精酒精藍(lán)色研磨過(guò)濾離心管離心配對(duì)加冷酒精白色絮狀物◆自我診斷◆判斷正誤(正確的打“√”，錯(cuò)誤的打“×”)1．切割質(zhì)粒的限制性?xún)?nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。(

)2．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因。(

)3．DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)氫鍵連接起來(lái)。(

)4．當(dāng)作載體的質(zhì)粒DNA分子上至少含一個(gè)限制酶切割位點(diǎn)。(

)5．限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種×××√工具酶。(

)6．E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。(

)7．可用豬血代替香蕉作為DNA粗提取和鑒定的實(shí)驗(yàn)材料。(

)8．在DNA溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱，檢測(cè)結(jié)果呈藍(lán)色。(

)×××√◆精準(zhǔn)答題◆如圖所示，四種質(zhì)粒含有E1和E2兩種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，ampr表示氨芐青霉素抗性基因，tetr表示四環(huán)素抗性基因。(1)將兩端用E1切開(kāi)的tetr基因與用E1切開(kāi)的質(zhì)粒X——1混合連接，連接后獲得的質(zhì)粒類(lèi)型有_____________(填字母，多選)。A．X——1

B．X——2C．X——3D．X——4A、B、C(2)若將上圖所示X——1、X——2、X——3、X——4四種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(敏感型)，然后分別涂布在含有氨芐青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上。在這兩種培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞類(lèi)型有_______________、___________________。(3)如果X——1用E1酶切，產(chǎn)生850對(duì)堿基和3550對(duì)堿基兩種片段，那么質(zhì)粒X——2(tetr基因的長(zhǎng)度為1200對(duì)堿基)用E2酶切后的片段長(zhǎng)度為_(kāi)____________對(duì)堿基。(4)若將外源的tetr基因兩端用E2切開(kāi)，再與用E2切開(kāi)的X——1混合連接，無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞含X——3的細(xì)胞4750并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，結(jié)果顯示，含X——4的細(xì)胞數(shù)與含X——1的細(xì)胞數(shù)之比為1∶3，增大DNA連接酶用量能否提高上述比值？________。原因是____________________________________________________。【解析】(1)因目的基因和質(zhì)粒都是用E1切開(kāi)且X——1質(zhì)粒上有兩個(gè)E1酶切位點(diǎn)，故ampr基因和tetr基因的黏性末端相同，既可能出現(xiàn)ampr基因和X——1連接的產(chǎn)物(X——1)，也可能出現(xiàn)tetr基因和X——1連接的產(chǎn)物(X——2)，還可能出現(xiàn)X——1兩端連接形成的產(chǎn)物(X——3)。(2)X——1含有ampr基因，該基因表達(dá)后對(duì)氨芐青霉素有抗性，X——2含有tetr基因，該基因表達(dá)后對(duì)四環(huán)素有抗性，X——3不含抗性基因，不能DNA連接酶對(duì)DNA片段沒(méi)有選擇性(或DNA末端相同)X——4同時(shí)含有ampr和tetr基因，ampr和tetr基因表達(dá)后，對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素都有抗性。因此在含有氨芐青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)的大腸桿菌中不含X——1、X——2、X——4，即無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞和含X——3的細(xì)胞。(3)若用E1酶切X——1，產(chǎn)生850對(duì)堿基的含ampr基因大部分的堿基片段和3550對(duì)堿基的含有E2酶切位點(diǎn)的片段，含3550對(duì)堿基的片段與tetr基因形成含有4750個(gè)堿基對(duì)的X——2質(zhì)粒。用E2酶切割質(zhì)粒，由環(huán)狀變?yōu)殒湢?，堿基對(duì)數(shù)不變。(4)含X——4的細(xì)胞數(shù)與含X——1的細(xì)胞數(shù)的比值與這兩種質(zhì)粒的數(shù)量有關(guān)，這兩種質(zhì)粒的形成是通過(guò)末端隨機(jī)結(jié)合形成堿基對(duì)，再由DNA連接酶連接缺口，而DNA連接酶對(duì)該DNA片段無(wú)選擇作用，故增加DNA連接酶的用量，不改變題中的比值。命題探究命題探究一基因工程的工具分析

1．有關(guān)限制性?xún)?nèi)切核酸酶的易錯(cuò)點(diǎn)(1)限制性?xún)?nèi)切核酸酶是一類(lèi)酶而不是一種酶。(2)限制性?xún)?nèi)切核酸酶作用于磷酸二酯鍵，而不是氫鍵。(3)不同種類(lèi)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別的序列與切割的位點(diǎn)不同，這體現(xiàn)了酶的專(zhuān)一性特點(diǎn)。(4)在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需在目的基因的兩端都用限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割，使目的基因的兩端都有可連接的末端。(5)限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列一般由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。(6)兩個(gè)末端若是由同一種限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割產(chǎn)生的，則兩片段連接后還具有該種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。2．限制酶的選擇方法(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶Sma

Ⅰ會(huì)破壞標(biāo)記基因。3．與DNA有關(guān)的四種酶的比較項(xiàng)目限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脫氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對(duì)間的氫鍵作用結(jié)果形成黏性末端或平末端形成重組DNA分子形成新的DNA分子形成單鏈DNA分子4.載體上標(biāo)記基因的作用載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，作用機(jī)理如圖所示：例1[2023·全國(guó)卷真題]某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

)A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接【解析】酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和C酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的重組表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。即時(shí)鞏固某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入ampr或tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(ampr表示氨芐青霉素抗性基因，tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的被轉(zhuǎn)化，有的未被轉(zhuǎn)化，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有____________________________________________________________(答出兩點(diǎn))，而作為基因表達(dá)載體，除滿(mǎn)足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是___________________________________________________________；并且________________和含有復(fù)制起點(diǎn)、具有標(biāo)記基因、含有一種或多種限制酶識(shí)別序列兩者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)含有質(zhì)粒載體_________________________________________________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是______________________________________________________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有____________的固體培養(yǎng)基。

【解析】(1)質(zhì)粒能作為基因工程的載體的條件是質(zhì)粒含有復(fù)制起點(diǎn)、具有標(biāo)記基因、含有一種或多種限制酶識(shí)別序列等。(2)用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基對(duì)未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和被轉(zhuǎn)化的三種大腸桿菌進(jìn)行篩選時(shí)，未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或含有重組質(zhì)粒)兩者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)四環(huán)素菌均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)，故兩者無(wú)法區(qū)分；含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，故兩者也無(wú)法區(qū)分，但前者細(xì)胞內(nèi)還含有四環(huán)素抗性基因，而后者細(xì)胞內(nèi)含有的重組質(zhì)粒在插入目的基因時(shí)四環(huán)素抗性基因被破壞，因此在含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上前者能生長(zhǎng)，后者不能生長(zhǎng)。命題探究二DNA的粗提取和鑒定分析

1．DNA與蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同項(xiàng)目溶解規(guī)律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白質(zhì)NaCl溶液物質(zhì)的量濃度從2mol/L逐漸降低的過(guò)程中，蛋白質(zhì)溶解度逐漸增大部分發(fā)生鹽析沉淀溶解2.DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)分析實(shí)驗(yàn)材料的選取凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，不能作為實(shí)驗(yàn)材料不同實(shí)驗(yàn)材料的處理方式若實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，加入一定的研磨液，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集濾液；若實(shí)驗(yàn)材料是動(dòng)物細(xì)胞(如雞血細(xì)胞)，在其中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可SDS和EDTA在防止DNA降解中的作用SDS是蛋白質(zhì)變性劑，能使核蛋白變性并與DNA分離；EDTA是離子螯合劑，能結(jié)合DNA酶的激活劑——鎂離子，能抑制DNA酶的活性提取和分離DNA用塑料離心管的原因細(xì)胞破碎后釋放出的DNA容易被玻璃容器吸附；由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少選擇玻璃棒且攪拌緩慢的原因玻璃棒有吸附DNA的作用，濃縮后的DNA絲狀物可以用緩緩攪動(dòng)玻璃棒的方法卷起；玻璃棒攪拌速度過(guò)快，會(huì)導(dǎo)致DNA斷裂，無(wú)法獲得完整DNA例2下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是(

)A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B．DNA析出過(guò)程中，攪拌操作要輕柔，以防DNA斷裂C．預(yù)冷的酒精可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNAD．用二苯胺試劑鑒定DNA時(shí)需要進(jìn)行水浴加熱A【解析】哺乳動(dòng)物(如兔)成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，細(xì)胞內(nèi)基本不含DNA，故用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量不相近，A錯(cuò)誤；DNA析出過(guò)程中，攪拌操作要輕柔，以防止DNA斷裂，B正確；DNA不溶于冷酒精，向DNA提取液中加入適量預(yù)冷的酒精溶液，會(huì)使DNA析出，從而進(jìn)一步提純DNA，C正確；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱10min，溶液出現(xiàn)藍(lán)色，D正確。即時(shí)鞏固[2024·金華一中模擬]從目標(biāo)生物提取分離DNA，是基因工程操作的基礎(chǔ)。下列關(guān)于“DNA粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是(

)A．95%的冷酒精能除去蛋白質(zhì)形成含雜質(zhì)較少的DNAB．沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑，顏色呈藍(lán)色C．香蕉、新鮮豬血、菜花等動(dòng)植物材料均可用于DNA的粗提取D．EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解C【解析】DNA粗提取中，使用95%的冷酒精使DNA析出的原理是DNA不溶于95%的冷酒精，因此能除去蛋白質(zhì)形成含雜質(zhì)較少的DNA，A正確；沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑變藍(lán)，B正確；哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，所以豬血不能用于DNA的粗提取，而香蕉、菜花等植物材料可以用于DNA的粗提取，C錯(cuò)誤；DNA酶可以水解DNA，EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解，D正確。課標(biāo)要點(diǎn)二基因工程的基本操作程序與DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定主干梳理1．基因工程的基本操作程序獲取______________、構(gòu)建__________________、將重組DNA分子導(dǎo)入______________、檢測(cè)目的基因及其____________等步驟。目的基因重組DNA分子受體細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物2．原核細(xì)胞基因與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的異同項(xiàng)目編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列啟動(dòng)子終止子外顯子內(nèi)含子原核細(xì)胞連續(xù)的有。位于基因的“上游”，有_____________結(jié)合的位點(diǎn)，控制_____的開(kāi)始

有。位于_________，當(dāng)RNA聚

合

酶到達(dá)時(shí)，釋

放

出RNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄結(jié)束無(wú)______真核細(xì)胞不連續(xù)的有。編碼蛋白質(zhì)的序列有。不能編碼蛋白質(zhì)的序列RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄基因末端無(wú)3.獲取目的基因的方法(1)_______________(已知序列)：將核苷酸按照特定順序一個(gè)一個(gè)地連接起來(lái)。此方法成本較高，適于合成序列________的基因。(2)借助載體建立_____________①基因組文庫(kù)：把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與________組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆，基因組中所有DNA序列克隆的總匯被稱(chēng)為基因組文庫(kù)。②構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法：從特定的組織或細(xì)胞中提取并純化全部化學(xué)合成法較短基因文庫(kù)載體__________，然后在____________等酶的催化下，以mRNA為模板合成互補(bǔ)的DNA，即cDNA。最后，借助載體，利用與構(gòu)建基因組文庫(kù)相同的方法構(gòu)建cDNA文庫(kù)。(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(__________技術(shù))①特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、________、靈敏。②應(yīng)用：醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)鑒定、古生物學(xué)研究等方面。③模板：_____________________。④原料：4種___________________，即dNTP，N代表A、T、G、C四種mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶PCR快速待擴(kuò)增的DNA分子脫氧核苷三磷酸堿基。⑤酶：__________________________。⑥引物：兩段很短的單鏈DNA，分別可以與兩條______________復(fù)制起始端互補(bǔ)配對(duì)成小段雙鏈。⑦過(guò)程：包括多次________，每個(gè)循環(huán)分為3個(gè)步驟。變性：模板DNA雙鏈在高溫下(90～95℃)________斷裂，解旋成2條DNA單鏈

↓耐高溫的TaqDNA聚合酶DNA模板鏈循環(huán)氫鍵________：溫度降低(50～60℃)后，2個(gè)引物分別與各自互補(bǔ)的________________結(jié)合

↓延伸：分別以?xún)蓷lDNA單鏈為模板，4種脫氧核苷三磷酸為原料，耐高溫的_________________酶在適宜的溫度(約72℃)下，以________與模板形成的小段DNA雙鏈區(qū)為起點(diǎn)，催化合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈退火DNA單鏈TaqDNA聚合引物4．利用表達(dá)載體構(gòu)建重組DNA分子(1)____________：用于大量擴(kuò)增外源DNA的載體。(2)____________：使目的基因既能擴(kuò)增又能表達(dá)出相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體。表達(dá)載體包含適當(dāng)?shù)腳_______和________信號(hào)。(3)用________限制性?xún)?nèi)切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及____________，然后用______________將它們連接起來(lái)，可完成體外重組，形成重組的DNA分子。(4)基因表達(dá)載體的組成克隆載體表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄翻譯同種表達(dá)載體DNA連接酶上游RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄目的基因末端標(biāo)記基因5．將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞(1)________________：接受目的基因的細(xì)胞。(2)根據(jù)受體細(xì)胞類(lèi)型可選擇不同的基因?qū)敕椒ǚN類(lèi)微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞常用方法Ca2＋處理法______________農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法受體細(xì)胞原核細(xì)胞受精卵_____________轉(zhuǎn)化過(guò)程Ca2＋處理細(xì)胞→___________細(xì)胞→________________與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子目的基因表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→_____________→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物目的基因插入___________的T——DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞DNA中→表達(dá)受體細(xì)胞顯微注射法體細(xì)胞感受態(tài)重組DNA分子顯微注射Ti質(zhì)粒6.檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物(1)借助載體上的____________可以檢測(cè)____________是否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定地存在并遺傳。(2)利用PCR技術(shù)檢測(cè)①根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)PCR________，利用待檢DNA為模板進(jìn)行PCR；②通過(guò)________或DNA測(cè)序技術(shù)鑒定PCR產(chǎn)物。(3)利用核酸分子雜交技術(shù)檢測(cè)標(biāo)記基因目的基因引物電泳①用化學(xué)方法使待檢的DNA變性成________并固定在________________上；②加入________，在適當(dāng)?shù)臈l件下探針與________的目的基因片段形成雙鏈；③漂洗硝酸纖維素膜去除________結(jié)合的探針后，若硝酸纖維素膜仍具有____________或熒光，則可判斷待檢DNA中含有目的基因；④運(yùn)用核酸分子雜交技術(shù)還可檢測(cè)受體細(xì)胞中是否含有目的基因轉(zhuǎn)錄出的____________。單鏈硝酸纖維素膜探針互補(bǔ)放射性mRNA未互補(bǔ)(4)___________________技術(shù)：以目的基因表達(dá)出的__________為抗原，制備能與其特異性結(jié)合的并能被放射性或熒光標(biāo)記的________。如果能探測(cè)到目的蛋白，則說(shuō)明目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。(5)觀察測(cè)定個(gè)體是否表現(xiàn)出目的基因控制的特定________并穩(wěn)定遺傳，是判斷轉(zhuǎn)基因成功的直接證據(jù)。抗原——抗體雜交蛋白質(zhì)抗體性狀7．活動(dòng)：PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)原理①使用PCR技術(shù)擴(kuò)增酵母細(xì)胞中編碼核糖體RNA的DNA部分片段，再通過(guò)___________________進(jìn)行鑒定。②使用___________對(duì)凝膠進(jìn)行染色，再用____________以及__________脫色，觀察并分析瓊脂糖凝膠中DNA條帶。瓊脂糖凝膠電泳亞甲基藍(lán)75%酒精蒸餾水(2)實(shí)驗(yàn)步驟微量移液器微量離心管底部PCR儀-20電泳緩沖液0.1%亞甲基藍(lán)75%酒精蒸餾水45透明玻璃板加樣孔位置長(zhǎng)度◆自我診斷◆判斷正誤(正確的打“√”，錯(cuò)誤的打“×”)1．外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制。(

)2．檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原——抗體雜交技術(shù)。(

)3．表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均啟動(dòng)于復(fù)制起點(diǎn)。(

)4．應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá)。(

)××××5．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。(

)6．瓊脂糖凝膠電泳法可用于PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。(

)7．轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉植株抗蟲(chóng)效果的鑒定必須通過(guò)分子檢測(cè)。(

)√√×◆精準(zhǔn)答題◆草甘膦是一種非選擇性除草劑，殺死雜草的同時(shí)也殺死農(nóng)作物。它與植物體內(nèi)的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)結(jié)構(gòu)相似，可與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶，阻止PEP轉(zhuǎn)化，影響植物細(xì)胞正常代謝。我國(guó)科學(xué)家從草甘膦施用土壤中的某微生物體內(nèi)獲取GR79基因(草甘膦抗性基因)，并將其導(dǎo)入植物體細(xì)胞中獲得抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植物。據(jù)圖回答下列問(wèn)題。(1)GR79基因發(fā)揮抗草甘膦作用的機(jī)理可能是_______________________________________________________________。從分離得到的某土壤微生物體內(nèi)獲取含有GR79基因的質(zhì)粒，并將其保存在某細(xì)菌群體(受體菌)中，各個(gè)受體菌分別含有該微生物的不同的基因，這些受體菌群中該微生物的所有DNA序列克隆的總匯，稱(chēng)為_(kāi)_______________________。(2)據(jù)圖推測(cè)，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增GR79基因時(shí)，需設(shè)計(jì)能與該基因兩條模板鏈3′端_________________的引物；同時(shí)為構(gòu)建該基因表達(dá)載體，需在引物1和引物2的_____端加上限制酶_________________的識(shí)別序列。GR79基因表達(dá)的產(chǎn)物阻止(或抑制)草甘膦與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶基因文庫(kù)(或基因組文庫(kù))堿基互補(bǔ)配對(duì)5′PstⅠ和XhoⅠ(3)實(shí)驗(yàn)中常采用_______________法將GR79基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物受體細(xì)胞。為避免該基因在近緣農(nóng)作物中傳播，可將其導(dǎo)入植物受體細(xì)胞的___________________________________________________________________。除溫度、酸堿度等環(huán)境因素外，影響該基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞成功率的因素有__________________________________________________。(4)為檢測(cè)GR79基因是否導(dǎo)入植物體細(xì)胞，可在培養(yǎng)基中添加____________篩選含該基因的受體細(xì)胞；也可利用_______________________________________技術(shù)更加精準(zhǔn)地進(jìn)行檢測(cè)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

細(xì)胞質(zhì)DNA上(或葉綠體DNA或線粒體DNA或葉綠體和線粒體DNA上)農(nóng)桿菌的種類(lèi)和活性、受體細(xì)胞的基因型和活性等草甘膦核酸分子雜交(或PCR和核酸分子雜交)若待檢DNA中含有該基因，則會(huì)發(fā)現(xiàn)硝酸纖維素膜上會(huì)出現(xiàn)_______________________。(5)經(jīng)檢測(cè)，科研人員發(fā)現(xiàn)部分獲得GR79基因的植物幼苗不具有抗草甘膦的能力，原因可能是______________________________________________?！窘馕觥?1)草甘膦與植物體內(nèi)的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)結(jié)構(gòu)相似，會(huì)與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶，影響細(xì)胞正常代謝，由此推測(cè)，GR79基因表達(dá)的產(chǎn)物能阻止(或抑制)草甘膦與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶，從而發(fā)揮放射性或熒光條帶GR79基因轉(zhuǎn)錄或翻譯異常(或GR79基因表達(dá)異常)抗草甘膦作用?；蛭膸?kù)能夠儲(chǔ)存一種生物的全部或者部分基因。(2)據(jù)圖推測(cè)，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增GR79基因時(shí)，需設(shè)計(jì)能與該基因兩條模板鏈3′端堿基互補(bǔ)配對(duì)的引物。由題圖可知，擴(kuò)增目的基因時(shí)，應(yīng)在引物的5′端添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列。由題圖中質(zhì)粒結(jié)構(gòu)可知，限制酶BamHⅠ的識(shí)別序列位于標(biāo)記基因中，不能選用，且為防止目的基因自身環(huán)化和反向插入，應(yīng)選擇兩種不同的限制酶，即PstⅠ和XhoⅠ，將它們的識(shí)別序列分別加在引物1和引物2的5′端。(3)實(shí)驗(yàn)中常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將GR79基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物受體細(xì)胞。為避免該基因在近緣農(nóng)作物中傳播，可將其導(dǎo)入植物受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)DNA上(或葉綠體DNA或線粒體DNA或葉綠體和線粒體DNA上)。除溫度、酸堿度等環(huán)境因素外，影響該基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞成功率的因素有農(nóng)桿菌的種類(lèi)和活性、受體細(xì)胞的基因型和活性等。(4)為檢測(cè)GR79基因是否導(dǎo)入植物體細(xì)胞，可在培養(yǎng)基中添加草甘膦篩選含該基因的受體細(xì)胞；也可利用核酸分子雜交技術(shù)(或PCR和核酸分子雜交技術(shù))更加精準(zhǔn)地進(jìn)行檢測(cè)，若待檢DNA中含有該基因，則會(huì)發(fā)現(xiàn)硝酸纖維素膜上會(huì)出現(xiàn)放射性或熒光條帶。(5)獲得GR79基因的植物幼苗通過(guò)基因表達(dá)可以表現(xiàn)出抗草甘膦的性狀，若不具有抗草甘膦的能力，則意味著草甘膦抗性基因(GR79基因)轉(zhuǎn)錄或翻譯異常，即草甘膦抗性基因(GR79基因)表達(dá)異常。命題探究命題探究一基因工程的基本操作程序分析

1．cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的主要區(qū)別文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小小大基因中啟動(dòng)子和終止子無(wú)有基因中內(nèi)含子無(wú)有(真核生物)無(wú)(原核生物)基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因基因獲得過(guò)程mRNAcDNA→與載體組合→導(dǎo)入微生物細(xì)胞→克隆基因組DNA適當(dāng)大小的DNA片段→與載體組合→導(dǎo)入微生物細(xì)胞→克隆2.三種獲取目的基因方法的比較項(xiàng)目化學(xué)合成法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)建立基因文庫(kù)法適用對(duì)象目的基因序列已知目的基因序列已知目的基因序列未知過(guò)程①以單個(gè)脫氧核苷酸為原料按照已知DNA序列直接人工合成②逆轉(zhuǎn)錄法：獲取mRNA→合成DNA單鏈→合成DNA雙鏈(目的基因)在體外通過(guò)酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增特定的DNA片段，即目的基因利用限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶、質(zhì)粒等工具建立基因文庫(kù)→篩選出目的基因優(yōu)缺點(diǎn)專(zhuān)一性強(qiáng)，獲取的目的基因較少速度快，以指數(shù)方式擴(kuò)增操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但工作量大3.利用雙酶切法構(gòu)建重組DNA分子雙酶切法是指用兩種能產(chǎn)生不同黏性末端的限制酶分別同時(shí)切割載體和含有目的基因的DNA分子，以構(gòu)建重組DNA分子。由圖示可知，質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分別形成黏性末端1與2，目的基因所在的DNA分子經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分別形成黏性末端3與4。雙酶切法的優(yōu)點(diǎn)：①可避免載體和目的基因的自身環(huán)化(1與2不互補(bǔ)、3與4也不互補(bǔ))；②可避免載體與目的基因的反向連接(1只與3互補(bǔ)，2只與4互補(bǔ))。4．受體細(xì)胞拓展(1)對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，受體細(xì)胞可以是受精卵或體細(xì)胞，因?yàn)橹参锛?xì)胞具有全能性。(2)對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)，受體細(xì)胞一般是受精卵，因?yàn)槭芫训娜苄愿撸叨确只膭?dòng)物體細(xì)胞的全能性受到抑制。(3)大腸桿菌和酵母菌在基因工程中都可以作為受體細(xì)胞，但又有所不同。大腸桿菌為原核細(xì)胞，而酵母菌為真核細(xì)胞(具有多種細(xì)胞器)，所以在生產(chǎn)需要加工和分泌的蛋白質(zhì)時(shí)，酵母菌比大腸桿菌更有優(yōu)勢(shì)。(4)受體細(xì)胞的特點(diǎn)：能處于一種狀態(tài)，便于重組DNA分子導(dǎo)入；一般無(wú)標(biāo)記基因；缺乏限制性?xún)?nèi)切核酸酶，防止重組DNA分子被降解，使其在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在。提供Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌受體細(xì)胞比較：用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌應(yīng)為敏感菌和限制性?xún)?nèi)切核酸酶缺陷型。5．篩選含有目的基因的受體細(xì)胞(1)DNA雜交鑒定：如從受體細(xì)胞中提取DNA分子，并合成與目的基因序列互補(bǔ)的探針(基因探針就是用放射性同位素或熒光分子標(biāo)記的含目的基因的單鏈DNA片段)，進(jìn)行核酸分子雜交(如圖)。(2)鑒定該DNA分子中是否有目的基因，用限制性?xún)?nèi)切核酸酶進(jìn)行酶切，做酶切圖譜鑒定。(3)利用重組質(zhì)粒上的抗性基因、顯色反應(yīng)、噬菌斑、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等進(jìn)行鑒定。如以下案例：①原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。②被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。③篩選方法：將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖，其中能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，即圖中的1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。6．目的基因是否表達(dá)的檢測(cè)方法(1)使用“目的基因”作探針，運(yùn)用核酸分子雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出特定mRNA。(2)采用“抗原——抗體雜交技術(shù)”，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)(作抗原)與相應(yīng)抗體雜交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認(rèn)目的基因是否“指導(dǎo)”特定蛋白質(zhì)的合成。(3)采用抗蟲(chóng)、抗病毒等“接種實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行目的基因是否成功表達(dá)的“個(gè)體生物學(xué)”水平的檢測(cè)。例1[2023·湖北真題]用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D【解析】若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確。若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確。DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同，因此DNA凝膠電泳技術(shù)能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確。SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。即時(shí)鞏固1．PCR可用于擴(kuò)增并檢測(cè)DNA，但存在交叉污染或偏差等問(wèn)題，而新研發(fā)的基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的檢測(cè)方法，可在低濃度樣本中更靈敏，快速識(shí)別靶標(biāo)DNA。該系統(tǒng)利用gRNA介導(dǎo)Cas12a蛋白能準(zhǔn)確切割靶標(biāo)DNA。同時(shí)切割熒光底物使其發(fā)出熒光，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度確定靶標(biāo)DNA含量，利用Cas12a檢測(cè)靶標(biāo)DNA的過(guò)程如下圖所示。回答下列問(wèn)題。(1)根據(jù)圖中信息可推測(cè)Cas12a作用于靶標(biāo)DNA時(shí)，具有類(lèi)似________酶和________酶的功能；gRNA識(shí)別靶標(biāo)DNA，遵循的是___________________原則。(2)在構(gòu)建表達(dá)Cas12a蛋白的載體時(shí)，通常是將Cas12a基因插入lacZ基因內(nèi)，使lacZ基因失活，從而失去催化無(wú)色底物顯色的能力，ampr為氨芐青霉素抗性基因。理論上通過(guò)含氨芐青霉素且不含無(wú)色底物的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，不能篩選到含有Cas12a基因表達(dá)載體的工程菌，判斷的依據(jù)是_____________________________________________________________限制解旋堿基互補(bǔ)配對(duì)使用的培養(yǎng)基中不含無(wú)色底物，所以在含氨芐青霉素且不含無(wú)色底________________________________________________________________________________。(3)熒光檢測(cè)時(shí)，60min后三組熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到一致，原因是______________________________________________________。(4)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，增加NTC組作對(duì)照的作用是_______________________________________________________；g——3＋g——7組可更快檢測(cè)出靶標(biāo)DNA，原因是______________________________________________________________________________。物的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)長(zhǎng)出的菌落，無(wú)論Cas12a基因是否成功導(dǎo)入都不會(huì)出現(xiàn)顯色反應(yīng)Cas12a蛋白切割熒光底物使其發(fā)出熒光的物質(zhì)含量相同排除其他物質(zhì)介導(dǎo)Cas12a蛋白切割熒光底物使其發(fā)出熒光 g——3＋g——7組在介導(dǎo)Cas12a蛋白切割熒光底物使其發(fā)出熒光方面具有協(xié)同作用【解析】(1)根據(jù)圖中信息可推測(cè)Cas12a作用于靶標(biāo)DNA時(shí)，可以切割靶標(biāo)DNA，并能解開(kāi)靶標(biāo)DNA雙鏈，使其與g——3和g——7結(jié)合，所以Cas12a具有類(lèi)似限制酶和解旋酶的功能；gRNA識(shí)別靶標(biāo)DNA，遵循的是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。(2)在構(gòu)建表達(dá)Cas12a蛋白的載體時(shí)，通常是將Cas12a基因插入lacZ基因內(nèi)，使lacZ基因失活，從而失去催化無(wú)色底物顯色的能力，而使用的培養(yǎng)基中不含無(wú)色底物，所以在含氨芐青霉素且不含無(wú)色底物的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)長(zhǎng)出的菌落，無(wú)論Cas12a基因是否成功導(dǎo)入都不會(huì)出現(xiàn)顯色反應(yīng)。(3)熒光檢測(cè)時(shí)，60min后三組熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到一致，原因是Cas12a蛋白切割熒光底物使其發(fā)出熒光的物質(zhì)含量相同。(4)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，增加NTC組作對(duì)照的作用是排除其他物質(zhì)介導(dǎo)Cas12a蛋白切割熒光底物使其發(fā)出熒光；g——3＋g——7組可更快檢測(cè)出靶標(biāo)DNA，原因是g——3＋g——7組在介導(dǎo)Cas12a蛋白切割熒光底物使其發(fā)出熒光方面具有協(xié)同作用。2．[2024·蕭山中學(xué)模擬]枯草芽孢桿菌可分泌纖維素酶。研究者篩選到一株降解纖維素能力較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌株(B菌)，從中克隆得到了一種纖維素酶(C1酶)基因。將獲得的C1酶基因與高效表達(dá)載體(HT質(zhì)粒)連接，再導(dǎo)入B菌，以期獲得降解纖維素能力更強(qiáng)的工程菌。(1)對(duì)克隆得到的C1酶基因測(cè)序，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對(duì)不同，但兩者編碼出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同，這是因?yàn)開(kāi)________________________________________________________。(2)C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?′→3′。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質(zhì)粒連接，克隆C1酶密碼子具有簡(jiǎn)并性，發(fā)生堿基的改變?nèi)匀痪幋a同一種氨基酸基因時(shí)在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。該基因內(nèi)部沒(méi)有這兩種酶切位點(diǎn)。圖1中酶切位點(diǎn)1和2所對(duì)應(yīng)的酶分別是_________________________________。酶切后的C1酶基因需要在_____________酶的作用下與HT質(zhì)粒連接構(gòu)建基因表達(dá)載體。一個(gè)基因表達(dá)載體的組成必須有啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制起點(diǎn)、_____________、____________等。BamHⅠ、SmaⅠ(順序不能調(diào)換)DNA連接目的基因標(biāo)記基因(3)轉(zhuǎn)化形成工程菌的過(guò)程中，應(yīng)先用___________處理枯草芽孢桿菌，使其處于容易吸收周?chē)鶧NA的狀態(tài)。(4)將纖維素含量為20%的培養(yǎng)基分為三組，一組接種工程菌，對(duì)照組1不進(jìn)行處理，對(duì)照組2進(jìn)行相應(yīng)處理。在相同條件下培養(yǎng)96小時(shí)，檢測(cè)培養(yǎng)基中纖維素的含量。圖2結(jié)果說(shuō)明工程菌降解纖維素的能力最強(qiáng)，推測(cè)對(duì)照組2的處理應(yīng)為_(kāi)________________。CaCl2接種(等量)B菌(5)預(yù)期該工程菌在處理廢棄物以保護(hù)環(huán)境方面可能的應(yīng)用：__________________________________________________________(舉一例)。【解析】(1)對(duì)克隆得到的C1酶基因測(cè)序，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對(duì)不同，但兩者編碼出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同，這是因?yàn)槊艽a子具有簡(jiǎn)并性，發(fā)生堿基的改變?nèi)匀痪幋a同一種氨基酸。(2)C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?′→3′，即轉(zhuǎn)錄是從DNA鏈的3′端開(kāi)始，再結(jié)合質(zhì)粒中啟動(dòng)子的方向可知，圖1中酶切位點(diǎn)1和2所對(duì)應(yīng)的酶分別是BamHⅠ、SmaⅠ。酶切后的C1酶基因降解秸稈，減少秸稈燃燒帶來(lái)的空氣污染；處理綠色廢棄物需要在DNA連接酶的作用下與HT質(zhì)粒連接構(gòu)建基因表達(dá)載體。一個(gè)基因表達(dá)載體的組成必須有啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制起點(diǎn)、目的基因、標(biāo)記基因等。(3)枯草芽孢桿菌應(yīng)先用Ca2＋處理，使其處于能吸收周?chē)鶧NA的感受態(tài)狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)化形成工程菌。(4)將纖維素含量為20%的培養(yǎng)基分為三組，一組接種工程菌，對(duì)照組1不進(jìn)行處理，對(duì)照組2向培養(yǎng)基中接種(等量)B菌。在相同條件下培養(yǎng)96小時(shí)，檢測(cè)培養(yǎng)基中纖維素的含量。結(jié)果接種工程菌的一組培養(yǎng)基中纖維素含量最低，說(shuō)明工程菌降解纖維素的能力最強(qiáng)。(5)工程菌具有很強(qiáng)的降解纖維素的能力，因此該工程菌在處理廢棄物以保護(hù)環(huán)境方面可能的應(yīng)用是降解秸稈，減少秸稈燃燒帶來(lái)的空氣污染。命題探究二PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定分析

例2[2023·浙江6月選考真題]某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3——GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是(

)A．Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因的表達(dá)B．翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3——GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子【解析】分析題圖可知，啟動(dòng)子在左側(cè)，GFP基因整合到Gata3基因的右側(cè)，啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄后，可以使GFP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動(dòng)子B能控制GFP基因的表達(dá)，A錯(cuò)誤；因?yàn)閱?dòng)子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長(zhǎng)，2號(hào)個(gè)體只有大片段，所以是Gata3——GFP基因純合子，4號(hào)個(gè)體只有小片段，是野生型，C錯(cuò)誤；用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段大小差異較小，無(wú)法較好地區(qū)分雜合子和純合子，D錯(cuò)誤。即時(shí)鞏固[2024·臺(tái)州模擬]人類(lèi)γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，基因的表達(dá)被抑制。通過(guò)改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療。科研人員擴(kuò)增了基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是___________，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是__________。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程具體需要_____種酶，它們分別是________________________________________________________________________________________。(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光的原SalⅠEcoRⅠ6 TaqDNA聚合酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA連接酶因是_______________________________________________________。(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光，F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光。若基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測(cè)，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于_______________________________________________，理由是________________________________________________________________________________________________________________________引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá)

根據(jù)有無(wú)熒光情況判斷，F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè))；F5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物_____________________________________________________________________________________________________________________________?！窘馕觥?1)由題圖可知，熒光蛋白基因的左側(cè)為終止子，為了將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，則擴(kuò)增后的產(chǎn)物的插入點(diǎn)應(yīng)在熒光蛋白基因的右側(cè)，而熒光蛋白基因的右側(cè)有3個(gè)限制酶切點(diǎn)，分別是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶的切點(diǎn)，但因?yàn)橛肊coRⅠ酶切會(huì)破壞熒光蛋白基因，所以只能用Mun

Ⅰ和XhoⅠ限制酶切割，擴(kuò)增后的產(chǎn)物的兩端添加限制酶后得到的DNA片段能夠替換位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位點(diǎn)之間的片段，并能與左側(cè)的熒光蛋白基因片段和

上均無(wú)結(jié)合位點(diǎn)，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上右側(cè)的P片段連接起來(lái)。由于F1～F7中有XhoⅠ限制酶切割位點(diǎn)，所以需尋找能代替XhoⅠ限制酶，且切割后的產(chǎn)物能與XhoⅠ限制酶切割后的產(chǎn)物連接的限制酶，而SalⅠ限制酶就符合這一要求，所以在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是SalⅠ；而調(diào)控序列及啟動(dòng)子中含有MunⅠ的切割位點(diǎn)，所以需尋找能代替MunⅠ限制酶，且切割后的產(chǎn)物能與MunⅠ限制酶切割后的產(chǎn)物連接的限制酶，而EcoRⅠ限制酶就符合這一要求，所以在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是EcoRⅠ。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程共需要TaqDNA聚合酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ和DNA連接酶，共6種酶。(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，說(shuō)明F1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因表達(dá)；含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光，說(shuō)明F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不能表達(dá)。(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，雌激素能誘導(dǎo)啟動(dòng)子發(fā)揮作用。構(gòu)建的載體含有BCL11A基因，導(dǎo)入構(gòu)建載體的受體細(xì)胞能合成BCL11A蛋白。含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，說(shuō)明F1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(調(diào)控啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá))，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè))；而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光，說(shuō)明F5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無(wú)結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子完整，熒光蛋白基因能表達(dá))，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上。課標(biāo)要點(diǎn)三基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程主干梳理1．基因工程改善了人類(lèi)的生活品質(zhì)缺陷基因正常功能的基因生物反應(yīng)器電泳2．蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸基因蛋白質(zhì)氨基酸核苷酸核苷酸絲氨酸3．以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)建立的基因數(shù)據(jù)庫(kù)是人類(lèi)共有的財(cái)富(1)2003年____________________測(cè)序完成，我國(guó)也參與其中并做出很大的貢獻(xiàn)。(2)基因測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，不僅________越來(lái)越快，而且________也越來(lái)越低。(3)多個(gè)國(guó)家和機(jī)構(gòu)建立了龐大的___________________。①數(shù)據(jù)庫(kù)信息不僅通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)共享，還定期交換數(shù)據(jù)進(jìn)行更新。②現(xiàn)在通過(guò)訪問(wèn)___________，任何人都可以方便地檢索出需要的信息。人類(lèi)基因組計(jì)劃速度成本生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)互聯(lián)網(wǎng)③科學(xué)家也能通過(guò)比對(duì)________或__________的序列重新審視生命進(jìn)化的歷程，深度解碼個(gè)人的_____________。核酸蛋白質(zhì)遺傳信息◆自我診斷◆判斷正誤(正確的打“√”，錯(cuò)誤的打“×”)1．由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應(yīng)用。(

)2．蛋白質(zhì)工程的目的是改造或合成人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)。(

)3．蛋白質(zhì)工程可以合成自然界中不存在的蛋白質(zhì)。(

)4．利用乳腺生物反應(yīng)器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因?yàn)閷⑷说难灏椎鞍谆驅(qū)肓藙?dòng)物的乳腺細(xì)胞中。(

)×√√×◆精準(zhǔn)答題◆[2023·湖南真題]基因檢測(cè)是診斷和預(yù)防遺傳病的有效手段。研究人員采集到一遺傳病家系樣本，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)此家系甲和乙兩個(gè)基因存在突變：甲突變可致先天性耳聾；乙基因位于常染色體上，編碼產(chǎn)物可將葉酸轉(zhuǎn)化為N5——甲基四氫葉酸，乙突變與胎兒神經(jīng)管缺陷(NTDs)相關(guān)；甲和乙位于非同源染色體上。家系患病情況及基因檢測(cè)結(jié)果如圖所示。不考慮染色體互換，回答下列問(wèn)題。(1)此家系先天性耳聾的遺傳方式是_______________________。Ⅰ——1和Ⅰ——2生育一個(gè)甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率是_________。(2)此家系中甲基因突變?nèi)缦聢D所示：正?；騿捂溒?′——ATTCCAGATC……(293個(gè)堿基)……CCATGCCCAG——3′突變基因單鏈片段5′——ATTCCATATC……(293個(gè)堿基)……CCATGCCCAG——3′研究人員擬用PCR擴(kuò)增目的基因片段，再用某限制酶(識(shí)別序列及切割位常染色體隱性遺傳病1/32點(diǎn)為)酶切，檢測(cè)甲基因突變情況，設(shè)計(jì)了一條引物為5′——GGCATG——3′，另一條引物為_(kāi)________________________(寫(xiě)出6個(gè)堿基即可)。用上述引物擴(kuò)增出家系成員Ⅱ——1的目的基因片段后，其酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為_(kāi)_______________bp(注：該酶切位點(diǎn)在目的基因片段中唯一)。(3)女性的乙基因純合突變會(huì)增加胎兒NTDs風(fēng)險(xiǎn)。葉酸在人體內(nèi)不能合成，孕婦服用葉酸補(bǔ)充劑可降低NTDs的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。建議從可能妊娠或孕前至少1個(gè)月開(kāi)始補(bǔ)充葉酸，一般人群補(bǔ)充有效且安全劑量為0.4～1.0mg·d－1，NTDs生育史女性補(bǔ)充4mg·d－1。經(jīng)基因檢測(cè)胎兒(Ⅲ——2)的5′——ATTCCA——3′8、302和310乙基因型為－/－，據(jù)此推薦該孕婦(Ⅱ——1)葉酸補(bǔ)充劑量為_(kāi)____mg·d－1?！窘馕觥?1)由遺傳系譜圖可知，由于Ⅰ——1與Ⅰ——2均表現(xiàn)正常，他們關(guān)于甲病的基因型均為＋/－，而他們的女兒Ⅱ－4患病，因此可判斷甲基因突變導(dǎo)致的先天性耳聾是常染色體隱性遺傳病。由Ⅰ——1、Ⅰ——2和Ⅱ——3關(guān)于乙病的基因可以推出乙基因突變導(dǎo)致的遺傳病也是常染色體隱性遺傳病，所以Ⅰ——1和Ⅰ——2生出一個(gè)甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率為1/4×1/4×1/2＝1/32。(2)研究甲基因突變的情況，Ⅱ——1為雜合子，兼有正常甲基因和突變4甲基因。已知設(shè)計(jì)了一條引物為5′——GGCATG——3′，與給出的甲基因(或甲突變基因)單鏈片段的3′端互補(bǔ)，則另一條引物應(yīng)與給出的甲基因(或甲突變基因)單鏈片段的互補(bǔ)鏈的3′端互補(bǔ)，即可以為5′——ATTCCA——3′?？蓴U(kuò)增出大量正常甲基因和突變甲基因供后續(xù)鑒定。此時(shí)酶切，正常甲基因酶切后片段長(zhǎng)度分別為8bp和302bp(2bp＋293bp＋7bp)，突變甲基因沒(méi)有識(shí)別序列，無(wú)法被酶切，其片段長(zhǎng)度為310bp。(3)Ⅲ——2關(guān)于乙的基因型為－/－，有患NTDs的可能，因此推薦該孕婦(Ⅱ——1)葉酸補(bǔ)充劑量為4mg·d－1。命題探究命題探究一基因工程的應(yīng)用

例1[2024·寧波效實(shí)中學(xué)模擬]回答下列關(guān)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的問(wèn)題。(1)將山核桃miRNA169基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，可促進(jìn)擬南芥提前開(kāi)花。提取山核桃根、莖、葉、雌花和果實(shí)中的RNA，經(jīng)___________形成cDNA，再利用PCR技術(shù)________并擴(kuò)增出大量miRNA169基因，用雙酶切法將miRNA169基因連接至表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入擬南芥愈傷組織細(xì)胞中，然后利用轉(zhuǎn)化細(xì)胞的________性，在含有抗生素和逆轉(zhuǎn)錄篩選全能_______________________________的MS培養(yǎng)基中經(jīng)分裂、分化、器官發(fā)生和形態(tài)建成，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。(2)W是一種具有特定功能的人體蛋白質(zhì)。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應(yīng)器的研究思路，制備一種膀胱生物反應(yīng)器來(lái)獲得W，基本過(guò)程如下圖所示。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)(或植物激素)步驟①中需要使用的工具酶有________________________________。步驟②和③所代表的操作分別是____________和_________________。步驟④通常需用特定激素處理代孕母體，以使其_________________________________。與乳腺生物反應(yīng)器相比，用膀胱生物反應(yīng)器獲得W的優(yōu)勢(shì)在于不受轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的年齡、性別以及_______________________________等的限制。(3)為培育能分泌酸性纖維素酶的乳酸菌，將乳酸菌與含酸性纖維素酶基因的重組質(zhì)粒共培養(yǎng)，加入__________________以增大乳酸菌細(xì)胞膜的通透性，便于乳酸菌發(fā)生轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的效率與乳酸菌的密度和生長(zhǎng)狀態(tài)、限制性?xún)?nèi)切核酸酶與DNA連接酶顯微注射胚胎體外培養(yǎng)同期發(fā)情(或處于相同生理狀態(tài))是否處于生殖期(或生長(zhǎng)時(shí)期)氯化鈣(或Ca2＋)__________________、無(wú)菌條件、無(wú)氧條件等密切相關(guān)。將處理后的培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋后接種至以__________為唯一碳源的平板培養(yǎng)基中篩選出成功轉(zhuǎn)化的乳酸菌，再采用________(填“靜置”或“振蕩”)培養(yǎng)法擴(kuò)大培養(yǎng)?！窘馕觥?1)提取得到的RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄可以形成cDNA，但因?yàn)樘崛〉玫降腞NA有多種，所以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA也有多種，可以通過(guò)PCR技術(shù)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則篩選出特定的基因片段并進(jìn)行擴(kuò)增。利用轉(zhuǎn)化細(xì)胞的全能性，在MS培養(yǎng)基中添加抗生素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，除去農(nóng)桿菌，誘導(dǎo)愈傷組織的分裂、分化。(2)形成重組表達(dá)載體的工具重組質(zhì)粒的濃度纖維素靜置酶是限制性?xún)?nèi)切核酸酶與DNA連接酶。步驟②將重組表達(dá)載體導(dǎo)入受精卵，需用到顯微注射技術(shù)，步驟③為受精卵發(fā)育成早期胚胎，需經(jīng)過(guò)胚胎體外培養(yǎng)，步驟④將早期胚胎移植入代孕母體，為保證移植胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育，需用特定激素處理代孕母體，使其處于同期發(fā)情狀態(tài)。膀胱生物反應(yīng)器不受生殖期的限制，不同發(fā)育階段都能獲得產(chǎn)物。(3)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸菌時(shí)，可用氯化鈣處理細(xì)菌以增大細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，提高轉(zhuǎn)化成功率。轉(zhuǎn)化效率還與乳酸菌的密度和生長(zhǎng)狀態(tài)、重組質(zhì)粒的濃度、無(wú)菌條件、無(wú)氧條件等密切相關(guān)。將處理后的培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋后接種至以纖維素為唯一碳源的平板培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)室中大規(guī)模培養(yǎng)微生物所用的培養(yǎng)基一般為液體培養(yǎng)基，乳酸菌為厭氧菌，故采用靜置培養(yǎng)法擴(kuò)大培養(yǎng)。即時(shí)鞏固基因定點(diǎn)整合可替換特定基因，該技術(shù)可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由某基因(A)突變引起的，將正常A基因定點(diǎn)整合到A基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上，替換突變基因，可用來(lái)研究該病的基因治療過(guò)程?；蚨c(diǎn)整合的過(guò)程如圖所示，已知neor基因可作為標(biāo)記基因，含有neor的細(xì)胞具有對(duì)G418的抗性?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)構(gòu)建重組載體，常用的工具酶有______________________。構(gòu)建重組載體時(shí)，需要大量A基因，常用_________技術(shù)合成A基因，利用該方法合成A基因時(shí)需要設(shè)計(jì)并合成______種引物。(2)將重組載體導(dǎo)入患病小鼠胚胎干細(xì)胞的常用方法為_(kāi)_____________。檢測(cè)患病小鼠胚胎干細(xì)胞中是否導(dǎo)入重組載體的方法是在含有________的培養(yǎng)液中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。(3)用圖中重組載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞時(shí)，會(huì)出現(xiàn)A基因錯(cuò)誤整合。錯(cuò)誤整合時(shí)，重組載體上的兩個(gè)HSV——tk至少會(huì)有一個(gè)與neor一起整合到染色體DNA上。已知HSV——tk1、HSV——tk2的產(chǎn)物都把DHPG轉(zhuǎn)化成限制酶和DNA連接酶PCR兩顯微注射法G418有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。將導(dǎo)入重組載體的胚胎干細(xì)胞置于同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，存活下來(lái)的是_____________(填“正確整合”或“錯(cuò)誤整合”)的胚胎干細(xì)胞，理由是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)將上述篩選得到的胚胎干細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因小鼠，還需要____________________________(答出兩點(diǎn))技術(shù)?！窘馕觥?1)構(gòu)建重組載體時(shí)，需要使用的工具酶為限制酶和DNA連接酶。正確整合

能在含有G418的培養(yǎng)液中存活，說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含neor，能在含DHPG的培養(yǎng)液中存活，說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中不含有HSV——tk胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植大量制備A基因，即特定基因的擴(kuò)增，常用PCR技術(shù)，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因時(shí)需要合成基因兩側(cè)的兩種不同的引物。(2)由題意可知，小鼠胚胎干細(xì)胞為受體細(xì)胞，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)將重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的常用方法為顯微注射法。由題意可知，neor為標(biāo)記基因，結(jié)合題中該基因的作用可知，欲篩選含有重組載體的小鼠胚胎干細(xì)胞，應(yīng)將處理后的胚胎干細(xì)胞放在含有G418的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，存活下來(lái)的即為導(dǎo)入重組載體的胚胎干細(xì)胞。(3)由題意可知，含有neor基因的細(xì)胞具有對(duì)G418的抗性，能在含G418的培養(yǎng)液中存活，說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含neor基因。HSV——tk1、HSV——tk2的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡，故能在含DHPG的培養(yǎng)液中存活，說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中不含HSV——tk，則在含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中能存活的胚胎干細(xì)胞中含neor基因，而不含HSV——tk，即發(fā)生正確整合的胚胎干細(xì)胞。(4)將正確整合的胚胎干細(xì)胞培育成小鼠，還需借助胚胎工程相關(guān)操作，如胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植等技術(shù)。命題探究二蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系項(xiàng)目蛋白質(zhì)工程基因工程區(qū)別操作過(guò)程預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→逆推出基因的脫氧核苷酸序列并改造→將改造的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并表達(dá)獲