醫(yī)學(xué)教材單細(xì)胞基因組測(cè)序在胰腺癌診治中的應(yīng)用研究-梁廷波

匯報(bào)人：梁廷波申報(bào)單位：浙江大學(xué)

單細(xì)胞基因組測(cè)序在胰腺癌診治中的應(yīng)用研究匯報(bào)內(nèi)容一、課題目標(biāo)二、研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費(fèi)預(yù)算匯報(bào)內(nèi)容一、課題目標(biāo)二、研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費(fèi)預(yù)算研究目標(biāo)完善胰腺癌患者CTC和CSC單細(xì)胞捕獲平臺(tái)，優(yōu)化單細(xì)胞的DNA/RNA提取、擴(kuò)增、和測(cè)序分析技術(shù)利用CTC單細(xì)胞測(cè)序?qū)ふ揖哂性缙谠\斷價(jià)值的生物標(biāo)志物利用CSC和CTC單細(xì)胞測(cè)序?qū)ふ乙认侔?fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，預(yù)測(cè)預(yù)后并實(shí)現(xiàn)有效干預(yù)腫瘤進(jìn)展利用CTC單細(xì)胞測(cè)序?qū)煰熜нM(jìn)行評(píng)估，尋找耐藥相關(guān)基因，探索個(gè)體化治療根據(jù)CTC單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，建立外周血檢測(cè)胰腺癌基因變異的循環(huán)腫瘤DNA（CirculatingtumorDNA,ctDNA）的方法匯報(bào)內(nèi)容一、課題目標(biāo)二、研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費(fèi)預(yù)算研究?jī)?nèi)容（1）單細(xì)胞操縱平臺(tái)的建立CTC、CSC捕獲、分離及技術(shù)優(yōu)化單細(xì)胞DNA/RNA微量擴(kuò)增、測(cè)序技術(shù)優(yōu)化單細(xì)胞克隆演化信息分析ctDNA的檢測(cè)技術(shù)開發(fā)研究?jī)?nèi)容（2）早期診斷復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移藥物治療挖掘早期診斷新的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因研究化療耐藥機(jī)制尋找藥物治療靶點(diǎn)單細(xì)胞操縱平臺(tái)胰腺癌個(gè)體化綜合診治技術(shù)路線（1）單細(xì)胞分離捕獲DNA/RNA提取、MDA方法微量擴(kuò)增文庫(kù)構(gòu)建DNA測(cè)序/RNA測(cè)序數(shù)據(jù)整合分析單細(xì)胞測(cè)序變異ctDNA檢測(cè)原發(fā)/轉(zhuǎn)移瘤組織外周血LCM/液態(tài)挑取(CSC-CD133與CD44+cMet)CellSearch微流控芯片SET-iFISHLCM/液態(tài)挑取技術(shù)路線（2）外周血CTC正常人10例胰腺癌10例挖掘早期診斷新的生物標(biāo)記物癌前病變10例潛在的分子標(biāo)記物L(fēng)iquidBiopsy正常人/癌前病變/胰腺癌各50例臨床驗(yàn)證技術(shù)路線（3）發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)相關(guān)基因

胰腺癌根治性切除術(shù)20例術(shù)中門脈血/外周血各10mLCTC

術(shù)后每三月隨訪一次獲取外周血CTC無(wú)復(fù)發(fā)局部復(fù)發(fā)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)

三年外周血CTC復(fù)發(fā)腫瘤組織原發(fā)瘤組織CSC技術(shù)路線（4）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因局部晚期胰腺癌10例轉(zhuǎn)移胰腺癌10例可切除胰腺癌10例原發(fā)瘤CSC原發(fā)瘤CSC轉(zhuǎn)移瘤vs.vs.單細(xì)胞克隆演化信息分析技術(shù)路線（5）不可切除胰腺癌20例可切除胰腺癌20例輔助化療DFS評(píng)價(jià)一線化療PFS、OS評(píng)價(jià)50例患者進(jìn)行驗(yàn)證50例患者進(jìn)行驗(yàn)證研究化療耐藥機(jī)制尋找藥物治療靶點(diǎn)胰腺癌CTC鑒定捕獲技術(shù)總結(jié)前期研究基于表面標(biāo)記物（EpCAM）的分離方法：-Cellsearch（在胰腺癌CTC捕獲中效率低，可能由于EpCAM等上皮標(biāo)記物在CTC中多表達(dá)缺失）基于細(xì)胞大小差異的分離方法：-ISET(Isolationbysizeofepithelialtumorcells)，問(wèn)題在于獲取的膜上的細(xì)胞不易被分離下來(lái)陰性富集（去除RBC、WBC）+免疫熒光染色-Inertialfocusingdevice,SET-iFISHCD45DAPIPan-CKFISH-CEP8SET-iFISH鑒定胰腺癌CTC:DAPI+CD45-CK+/-FISH+上皮標(biāo)記物（CK、EpCAM等）常缺失前期研究鑒定獲得的胰腺癌CTC最終經(jīng)LCM或液態(tài)口吸法挑取最終得到單細(xì)胞微流控注射泵后期被黏附細(xì)胞的收集二維芯片（CTCs富集）前期研究基于電活性薄膜的CTC捕獲芯片微電壓響應(yīng)的界面材料和EpCAM抗體黏附分子的二維CTCs細(xì)胞捕獲芯片BenWang;ACSAppliedMaterials&Interface;underrevision.胰腺癌CTC1.25V具體任務(wù)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)2-3個(gè)與胰腺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)的基因；發(fā)現(xiàn)1-2個(gè)具有高度敏感性和特異性的基因水平診斷標(biāo)記物；發(fā)現(xiàn)2-3個(gè)預(yù)后判斷和化療耐藥的標(biāo)記物；撰寫高質(zhì)量SCI學(xué)術(shù)論文5～8篇，其中相關(guān)權(quán)威期刊3～5篇，影響因子大于10分以上1～2篇。參加國(guó)際會(huì)議交流、發(fā)言2～3次；申請(qǐng)國(guó)內(nèi)外技術(shù)發(fā)明專利2～3項(xiàng)；爭(zhēng)取獲得全國(guó)百篇優(yōu)秀博士畢業(yè)論文1篇；培養(yǎng)碩士研究生2～3名，博士研究生1～2名；匯報(bào)內(nèi)容一、課題目標(biāo)二、研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費(fèi)預(yù)算研發(fā)團(tuán)隊(duì)胰腺癌治療歷史悠久，全國(guó)首例胰腺癌根治性切除手術(shù)；國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)；

現(xiàn)為浙江省“胰腺癌綜合診治創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”；每年診治胰腺癌500余例，手術(shù)技術(shù)達(dá)國(guó)際先進(jìn)水平；

與國(guó)外最著名的幾大胰腺癌中心建立了廣泛的合作；

擁有完善的胰腺癌生物樣本庫(kù)。浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院—牽頭單位

復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院、北京大學(xué)一院均為國(guó)內(nèi)大規(guī)模胰腺癌診治中心之一；

每年診治胰腺癌患者合計(jì)1000例以上，根治性切除500例以上；合作單位負(fù)責(zé)人楊尹默、樓文暉教授均為國(guó)內(nèi)胰腺外科著名專家；

深圳大學(xué)附屬一院在腫瘤單細(xì)胞捕獲技術(shù)以及基因測(cè)序上經(jīng)驗(yàn)豐富；

華大科技在基因高通量測(cè)序技術(shù)上國(guó)際領(lǐng)先；

約翰霍普金斯醫(yī)院在胰腺癌診治上世界第一，在ctDNA方面全球領(lǐng)先。研發(fā)團(tuán)隊(duì)合作單位工作基礎(chǔ)

在臨床方面，引領(lǐng)胰腺癌的綜合治療；

在基礎(chǔ)研究方面，在腫瘤的微環(huán)境、新生血管形成、免疫逃逸、耐藥機(jī)制、信號(hào)通路等取得了較多研究成果；

完成了相關(guān)多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目；Oncogene,2014,onlineMolCancerTher,2014,13,2062.Gastroenterology,2013,144,1230.AnnSurgOncol,2013,20,S725.AmJHumGenet,2013,93,249.Carcinogenesis,

2013,34,962.ClinCancerRes,2012,18,6339.Pancreatology,2012,12,183.AnnSurg,2012,255,326.SciTranslMed,2011,3,92ra66.AJG,2011,106,1521.CACancerJClin,2013,63,318.(影響因子153.459)CancerRes,2012,72,1363.(影響因子8.650)工作基礎(chǔ)

華大基因研究院在單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)處于國(guó)際領(lǐng)先水平Cell,2012,148,873.Cell,2012,148,886.約翰霍普金斯醫(yī)院具備國(guó)際上獨(dú)一無(wú)二的ctDNA研究實(shí)力NatMed,2008,14,985.SciTranslMed,2014,19,224ra24.梁廷波，教授，主任醫(yī)師，博導(dǎo)

教育部長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授

國(guó)家杰出青年基金獲得者衛(wèi)生部有突出貢獻(xiàn)中青年專家美國(guó)外科醫(yī)師學(xué)會(huì)會(huì)員（FACS），國(guó)際肝膽胰協(xié)會(huì)會(huì)員

中華外科學(xué)分會(huì)胰腺學(xué)組委員，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)胰腺癌專業(yè)委員會(huì)委員

浙江省胰腺癌綜合診治創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人

浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽胰外科主任曾獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)、省部級(jí)科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)4項(xiàng)以第一/通訊作者發(fā)表SCI論文40余篇項(xiàng)目負(fù)責(zé)人匯報(bào)內(nèi)容一、課題目標(biāo)二、研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費(fèi)預(yù)算經(jīng)費(fèi)預(yù)算序號(hào)預(yù)算科目名稱專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(萬(wàn)元)（一）直接費(fèi)用4711設(shè)備費(fèi)02材料費(fèi)116.003測(cè)試化驗(yàn)加工費(fèi)259.54燃料動(dòng)力費(fèi)05差旅費(fèi)11.006會(huì)議費(fèi)11.007國(guó)際合作與交流費(fèi)21.008出版/文獻(xiàn)/信息傳播/知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)費(fèi)8.009勞務(wù)費(fèi)44.5.0010專家咨詢費(fèi)0（二）間接費(fèi)用29.00合計(jì)500.00任務(wù)分工及經(jīng)費(fèi)分配浙醫(yī)二院350萬(wàn)復(fù)旦中山醫(yī)院50萬(wàn)北大一院50萬(wàn)華大科技10萬(wàn)協(xié)調(diào)課題整體實(shí)施；構(gòu)建單細(xì)胞捕獲平臺(tái)，提供80例胰腺癌樣本，與華大科技合作完成單細(xì)胞測(cè)序和分析，以及ctDNA檢測(cè)和分析20例胰腺癌樣本獲取、保存，基于CTC的胰腺癌早期診斷研究?jī)?yōu)化CTC、CSC單細(xì)胞捕獲平臺(tái)深大一院40萬(wàn)20例胰腺癌樣本獲取、保存，基于CTC的胰腺癌耐藥相關(guān)基因研究單細(xì)DNA/RNA測(cè)序及數(shù)據(jù)分析前期預(yù)實(shí)驗(yàn)課題年度計(jì)劃2015年利用Cellsearch與SET-iFISH捕獲胰腺癌CTC并進(jìn)行比較；建立并優(yōu)化液態(tài)挑取和LCM進(jìn)行單細(xì)胞捕獲；優(yōu)化微流控芯片系統(tǒng)分離單細(xì)胞技術(shù)；分離CSC單細(xì)胞；DNA/RNA微量擴(kuò)增，鑒定單細(xì)胞分離效果。 2016年對(duì)CTC、CSC單細(xì)胞進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，優(yōu)化生物信息學(xué)分析；基于此尋找胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、尋找具有早期診斷價(jià)