培訓(xùn)一各種引物設(shè)計

培訓(xùn)一各種引物設(shè)計基因定義基因組DNAcDNARNA提取1、家族基因。就是指具有相同功能得,不同基因。2、轉(zhuǎn)錄本。就是指一個基因有兩個不同得轉(zhuǎn)錄結(jié)果。都來自于一個基因,由于選擇性剪切導(dǎo)致得?；驍U增PCR體系:酶,緩沖液Buffer,dNTP,MgCl2,引物F,R。Forward,ReF引物R引物流程1、模板準備,引物準備2、PCR擴增3、片段回收4、連接TA克隆5、轉(zhuǎn)化大腸桿菌6、測序,確定序列7、提質(zhì)粒,保存菌液(15%-30%甘油)序列尋找exocytosisCs3g16120參考基因組網(wǎng)站:甜橙(Citrussinensis)。柑橘菌根模式:枳殼(Poncirustrif、),做為砧木,使用范圍最廣,抗寒。苜?；蚪M:。NCBI:文獻搜索:基因研究情況。1、枳殼中基因,做亞細胞定位克隆啟動子(用DNA)ATG前2kb,基因序列(用RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA)。2、對應(yīng)到苜蓿中基因,做RNAi功能驗證,熒光定量PCR驗證。(用cDNA克隆)引物設(shè)計原則1、長度:15—30bp,其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否則PCR得最適延伸溫度會超過Taq酶得最佳作用溫度(74度),從而降低產(chǎn)物得特異性。2、G十c含量:應(yīng)在40%一60%之間,PCR擴增中得復(fù)性溫度一般就是較低Tm值引物得Tm值減去5—10度。引物長度小于20時,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。3、Tm53-603、堿基分布得隨機性:應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上得單一堿基。尤其就是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個得連續(xù)G或C,否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。4、引物自身:不能含有自身互補序列,否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。5、引物之間:兩個引物之間不應(yīng)有多于4個得互補或同源堿基,不然會形成引物二聚體,尤應(yīng)避免3’端得互補重疊。6、上下游引物得互補性:一個引物得3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個引物得任何位點上。7、3’末端:如果可能得話,每個引物得3‘末端堿基應(yīng)為G或C。8、引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個核苷酸。示范。。。最普通得PCR引物設(shè)計。。。熒光定量PCR引物設(shè)計1、Tm60度。2、片段特異性。在基因組上,僅存在這一條片段,只能擴出這一條片段。選取3‘UTR區(qū)域。3、片段長度在60-100bp左右。酶切法構(gòu)建載體大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點1、選擇載體上得酶切位點。保證所需要得基因片段中不包含此酶切位點。2、添加酶切位點和保護堿基。都添加到引物得5’端。Topo克隆Gateway反應(yīng)RNAi超表達載體RNAi引