蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)蛋白質(zhì)制備

蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)得電泳分離電泳分離得原理:

蛋白質(zhì)就是兩性電解質(zhì),在一定得pH下,可以解離為帶電荷得離子。在電場中可以電泳移動。電泳遷移率:帶電顆粒在溶液中遷移速度得快慢,用電泳遷移率(M)表示:

M為遷移率;dL為顆粒移動得距離;L為通電得時(shí)間。E為兩個(gè)電極之間得電勢差。M=EtdL影響蛋白質(zhì)電泳遷移率得因素蛋白質(zhì)分子得性質(zhì)。分子得電荷、大小與形狀。電場與電流與電壓成正比。緩沖液與離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大,樣品所帶電荷降低,樣品得泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙得吸附作用最大,醋酸纖維素吸附作用較小。影響蛋白質(zhì)電泳遷移率得因素蛋白質(zhì)分子得性質(zhì)。分子得電荷、大小與形狀。電場與電流與電壓成正比。緩沖液與離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大,樣品所帶電荷降低,樣品得泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙得吸附作用最大,醋酸纖維素吸附作用較小。影響蛋白質(zhì)電泳遷移率得因素蛋白質(zhì)分子得性質(zhì)。分子得電荷、大小與形狀。電場與電流與電壓成正比。緩沖液與離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大,樣品所帶電荷降低,樣品得泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙得吸附作用最大,醋酸纖維素吸附作用較小。緩沖液與離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大,樣品所帶電荷降低,樣品得泳動速度會減緩。離子強(qiáng)度增強(qiáng),緩沖液所載得分電流隨之增加,樣品所載分電流降低,樣品電泳速度變慢離子強(qiáng)度太低,電導(dǎo)率太小,樣品移動緩慢影響蛋白質(zhì)電泳遷移率得因素蛋白質(zhì)分子得性質(zhì)。分子得電荷、大小與形狀。電場與電流與電壓成正比。緩沖液與離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大,樣品所帶電荷降低,樣品得泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙得吸附作用最大,醋酸纖維素吸附作用較小。電泳得類型自由界面電泳使用支持物得區(qū)帶電泳。

區(qū)帶電泳就是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液,然后加電場,分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)得作用主要就是為了防止機(jī)械干擾與由于溫度變化以及大分子溶液得高密度而產(chǎn)生得對流。區(qū)帶電泳使用不同得支持介質(zhì),早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂;以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜,現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺(PAGE)與瓊脂糖凝膠。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)聚丙烯凝膠電泳SDS凝膠等電聚焦SDS電泳在蛋白質(zhì)中加入摩爾比為1、4:1(SDS:蛋白質(zhì))得SDS(十二烷基硫酸鈉)。使所有蛋白質(zhì)都帶上負(fù)電。SDS就是陰離子去污劑,能與蛋白質(zhì)得疏水部分結(jié)合,并且把大部分蛋白質(zhì)拆成組成她得亞基形式。在上樣緩沖液中加入巰基乙醇,可以使二硫鍵還原為巰基。使不同得蛋白質(zhì)分子得短軸一致,長軸與蛋白質(zhì)得分子量成正比。SDS-PAG中,蛋白質(zhì)電泳得速度不再取決于蛋白質(zhì)得電荷與形狀,只與蛋白質(zhì)得分子量有關(guān)。SDS電泳當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí),蛋白質(zhì)得遷移率與分子量得對數(shù)呈線性關(guān)系,符合下式:logM=K-bX

M為分子量,X為遷移率,k、b均為常數(shù),若將已知分子量得標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)得遷移率對分子量對數(shù)作圖,可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳,根據(jù)它得電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS電泳繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:

按下式計(jì)算相對遷移率:

以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)得分子量對數(shù)對它得相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線,量出未知蛋白得遷移率即可測出其分于量,這樣得標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上得樣品得分子量測定才具有可靠性。SDS電泳PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng),分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類連續(xù)系統(tǒng)中,緩沖液pH值及凝膠濃度相同,帶電顆粒在電場作用下,主要靠電荷與分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中,由于緩沖液離子成分,pH,凝膠濃度及電位梯度得不連續(xù)性,帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng),分子篩效應(yīng),還具有濃縮效應(yīng),因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)SDS各部分凝膠配制電泳槽中加入緩沖液,接通電源,進(jìn)行電泳,開始電流恒定在10mA,當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA,溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí),停止電泳。Figure6、2、4SDSresultsoffractionS1(SRA)兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200兔肌動蛋白MW=43,000牛碳酸酐酶

MW=31,000胰蛋白酶抑制劑MW=20,100雞蛋清溶菌酶MW=14,400SDS應(yīng)注意得幾個(gè)問題制備凝膠時(shí),TEMED要加膠之前再加。電泳之前蛋白質(zhì)要溶解在含1%得SDS與1%得巰基乙醇得磷酸緩沖液(0、01mol/L,pH7、2),1000C加熱2~5分鐘。如凝膠中含有雜質(zhì),可以在加入樣品前先預(yù)電泳0、5~1小時(shí)。SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后,蛋白質(zhì)分子得構(gòu)象發(fā)生變化,解離為亞單位,電泳結(jié)果顯示得只就是亞單位得大小,同時(shí)蛋白質(zhì)也會失去原來得活性。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常得蛋白質(zhì),帶有較大輔基得蛋白質(zhì)(某些糖蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白,如膠原蛋白等。等電聚焦電泳

蛋白質(zhì)就是帶有電荷得兩性生物大分子,其正負(fù)電荷得數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度得變化而變化。在電場存在下得一定pH溶液中,帶正電得蛋白分子將向負(fù)極移動而帶負(fù)電得蛋白分子將向正極移動,在某一pH時(shí),蛋白分子在電場中不再移動,此時(shí)得pH值即為該蛋白質(zhì)得等電點(diǎn)。等電聚焦(IEF)電泳就就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加得pH梯度,處在其中得蛋白分子在電場得作用下運(yùn)動,最后各自停留在其等電點(diǎn)得位置上,測出蛋白分子聚焦位置得pH值,便可以得到它得等電點(diǎn)。等電聚焦電泳根據(jù)要分離得蛋白質(zhì)得pI得不同,訂購不同pH梯度得凝膠,可以對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。

如3、5~9、5、2、5~6、0、5、0~8、5、7、5~10等。凝膠得pH值范圍越窄,分辨力越高?？煞蛛x等電點(diǎn)相差0、01個(gè)pH單位得蛋白質(zhì),最高可以分辨0、0025個(gè)pH單位得蛋白質(zhì)。等電凝膠可以抵消擴(kuò)散作用,蛋白質(zhì)可以富集在很窄得區(qū)帶上。適用于少量蛋白質(zhì)樣品得分析鑒定,不適用于大量制備。要求用無鹽得溶液,而蛋白質(zhì)在無鹽溶液中容易沉淀;在等電點(diǎn)發(fā)生沉淀與變性得蛋白質(zhì)也不適合用次方法分離。pI得測定可以用染色法觀察蛋白質(zhì),然后用表面電極直接測量pH值?；?qū)⒛z切成小塊,加蒸餾水,再搗碎凝膠塊并且測量pH。雙向電泳雙向電泳:由第一向等電聚焦(IEF)電泳與第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成,第一向使等電點(diǎn)不同得蛋白得到分離,第二向使分子量不同得蛋白得到分離,兩向結(jié)合便得到高分辨率得蛋白圖譜。1975年,O’Farrell首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來此技術(shù)一直用于原核生物與真核生物總蛋白得分離。目前,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)得發(fā)展,雙向電泳技術(shù)越來越廣泛得用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。PAGE電泳分離得大分子得檢測考馬斯亮藍(lán)染色法

可檢出0、3~1ug得蛋白質(zhì)。銀染色法銀離子與蛋白質(zhì)以鹽或配價(jià)絡(luò)鹽得形式結(jié)合,用甲醛將銀離子還原為可見得銀顆粒?？蓹z測ng水平得蛋白質(zhì)。熒光染色技術(shù)熒光合成物質(zhì)與PAGE上得蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng),發(fā)出強(qiáng)烈得熒光,可檢測到PAGE中得蛋白質(zhì)。免疫印跡法蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,對新基因得表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分得抗體檢測。采用得就是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物就是蛋白質(zhì),“探針”就是抗體,“顯色”用標(biāo)記得二抗。具體操作為經(jīng)過PAGE分離得蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以固相載體上得蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)得抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記得第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離得特異性目得基因表達(dá)得蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平得表達(dá)。免疫印跡法抗原包被的實(shí)驗(yàn)?zāi)l

特異性人抗體標(biāo)記的二抗標(biāo)記免疫印跡法蛋白質(zhì)得結(jié)晶蛋白質(zhì)得結(jié)晶可以作為蛋白質(zhì)提純得方法之一。蛋白質(zhì)純度達(dá)到一定值時(shí)可以結(jié)晶。通過反復(fù)重結(jié)晶可以除去其中得雜質(zhì),使蛋白質(zhì)得到更大程度得純化。蛋白質(zhì)結(jié)晶體就是比較穩(wěn)定得結(jié)構(gòu),所以結(jié)晶可以作為一個(gè)穩(wěn)定得儲存得方法。在蛋白質(zhì)結(jié)晶之后,可以提供作X射線衍射分析用得材料,來分析蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)等數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)結(jié)晶得原理蛋白質(zhì)溶液在合適得過飽與狀態(tài),溶質(zhì)分子通過擴(kuò)散、旋轉(zhuǎn)、碰撞等運(yùn)動形式,可以形成晶核。溶質(zhì)分子以相互碰撞得作用方式有序而反復(fù)地堆砌在晶核上,直到晶核成長到晶體,最后從溶液中析出。晶體結(jié)晶得條件蛋白質(zhì)純度越高,結(jié)晶越容易,至少要在50%以上。蛋白質(zhì)濃度。濃度越高,結(jié)晶機(jī)會越大。但過大會因雜質(zhì)存在而導(dǎo)致晶形不好。一般結(jié)晶得蛋白質(zhì)濃度在10~50mg/mL。溫度。蛋白質(zhì)結(jié)晶溫度在0~400C。一般在40C冷室或250C溫箱中進(jìn)行。pH。一般在蛋白質(zhì)得等電點(diǎn)得pH附近結(jié)晶。金屬離子與離子強(qiáng)度。一些二價(jià)離子可以引起或有利于蛋白質(zhì)得結(jié)晶過程。沉淀劑。沉淀劑(如鹽類與各種有機(jī)溶劑)可改變蛋白質(zhì)得溶解度。理想得沉淀劑有:聚乙二醇(PEG)與2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)。蛋白質(zhì)結(jié)晶方法鹽析法在蛋白質(zhì)溶液中加入鹽,使蛋白質(zhì)溶解度降低,之后以結(jié)晶形式從溶液中析出。有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)介電常數(shù)降低,導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)晶析出。等電點(diǎn)結(jié)晶。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小,可以形成結(jié)晶。脫鹽結(jié)晶。一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水,可將溶于鹽溶液得蛋白質(zhì)結(jié)晶而出,然后透析除鹽。溫差除鹽。適用于一些對溫度敏感得蛋白質(zhì),不同溫度溶解度變化大?？蛇\(yùn)用此法。金屬離子。在某些蛋白質(zhì)溶液中加入金屬離子,可以促進(jìn)晶體得形成。蛋白質(zhì)提純過程中得定量蛋白質(zhì)得定量(1)定氮法測量蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量(克%)

=每克生物樣品中含氮得克數(shù)

6、25蛋白質(zhì)得定量(2)雙縮脲法第一個(gè)用比色法測定蛋白質(zhì)濃度得方法。

雙縮脲試劑得成分就是質(zhì)量濃度為0、1g/mL得氫氧化鈉溶液與質(zhì)量濃度為0、01g/mL得硫酸銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色得絡(luò)合物,這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似得肽鍵,因此,含兩個(gè)或亮個(gè)以上得肽鍵化合物尤其就是蛋白質(zhì)都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)物可在540nm處進(jìn)行比色測定可以測定蛋白質(zhì)得含量,可測定范圍為0、1~1、0mg/mL。

！此反應(yīng)為肽及蛋白質(zhì)特有得,而為氨基酸所沒有得一個(gè)顏色反應(yīng)。蛋白質(zhì)得定量(3)福林-酚試劑法:

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上得酚發(fā)生反應(yīng),生成藍(lán)色化合物,在600nm下測光吸收?？筛鶕?jù)測得得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)得含量。靈敏度較高,可達(dá)25

g-250g/ml。靈敏度比280nm處得紫外吸收法靈敏10倍,比雙縮脲法靈敏100倍。

蛋白質(zhì)得定量(4)紫外吸收法A、280nm光吸收法

根據(jù)得到得280nm得光吸收值與蛋白質(zhì)得濃度正比,可以測量蛋白質(zhì)溶液中得濃度。B、280nm與260nm得吸收差法用280nm下得紫外吸收減去260nm下得紫外吸收,可以排除260nm下由于核酸吸光帶來得干擾。蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=1、45*A280nm-0、74*A260nm