AbMole探索T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞疾?。簃6A 修飾對(duì) IRF8 的調(diào)控及作用機(jī)制

AbMole|探索T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞疾?。簃6A修飾對(duì)IRF8的調(diào)控及作用機(jī)制T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的血液惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來(lái)，N6-甲基腺苷（m6A）修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。來(lái)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院血液科清魯醫(yī)學(xué)院的YingZhou,MinJi,YuanXia等多名研究人員發(fā)表了題為《SilencingofIRF8Mediatedbym6AModificationPromotestheProgressionofT-CellAcuteLymphoblasticLeukemia》的研究成果。在該文章中，研究人員引用了AbMole的FB23-2（目錄號(hào)M9422）、ActinomycinD（目錄號(hào)M4881）。AbMole（奧默生物）提供高品質(zhì)抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、化合物庫(kù)。本研究旨在探討m6A修飾與T-ALL之間的關(guān)系，特別是其對(duì)干擾素調(diào)節(jié)因子8（IRF8）表達(dá)的影響以及對(duì)T-ALL細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。文章中主要分析了以下幾點(diǎn)：（一）IRF8在T-ALL患者中表達(dá)顯著降低通過(guò)對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)集的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)IRF8在T-ALL患者中的表達(dá)明顯低于健康供體和B-ALL患者。在基因表達(dá)分析中，從多中心研究的3個(gè)數(shù)據(jù)集中確定了43個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），IRF8是其中顯著下調(diào)的基因之一。在臨床樣本中，新診斷的T-ALL患者隊(duì)列的mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)也證實(shí)了IRF8的低表達(dá)，并且低水平的IRF8與不良的臨床指標(biāo)相關(guān)，如較短的無(wú)復(fù)發(fā)生存期、較高的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、較低的血小板計(jì)數(shù)和較高的骨髓原始細(xì)胞比例。（二）IRF8抑制T-ALL細(xì)胞的增殖和侵襲細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在T-ALL細(xì)胞系Molt4和Jurkat中過(guò)表達(dá)IRF8后，細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，EdU實(shí)驗(yàn)表明DNA復(fù)制率降低，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，G2/M期和S期細(xì)胞比例減少，同時(shí)細(xì)胞的集落形成能力也顯著下降。細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)過(guò)表達(dá)IRF8還抑制了T-ALL細(xì)胞的侵襲和遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)中，IRF8過(guò)表達(dá)組細(xì)胞穿透Matrigel-coatedmembrane的數(shù)量減少，遷移實(shí)驗(yàn)也顯示細(xì)胞的遷移能力受損。圖1抑制的IRF8表達(dá)是T-ALL增殖和侵襲的原因。（三）Irf8敲除促進(jìn)體內(nèi)Notch1誘導(dǎo)的T-ALL進(jìn)展研究人員構(gòu)建了動(dòng)物模型，將從Irf8+/+或Irf8-/-小鼠中分離的骨髓Lin-細(xì)胞感染表達(dá)NOTCH1胞內(nèi)域和綠色熒光蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒，然后移植到小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Irf8-/-組小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的T-ALL進(jìn)展，包括肝脾腫大、股骨蒼白、多器官白細(xì)胞增多、紅細(xì)胞減少和浸潤(rùn)。流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分析和組織學(xué)染色顯示，骨髓和血液中白血病淋巴母細(xì)胞頻率更高，Ki67水平增加，表明細(xì)胞增殖加快，并且中位生存時(shí)間縮短。圖2Irf8的敲除加速了Notch1誘導(dǎo)的T-ALL的進(jìn)展。（四）IRF8通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控PIK3R5抑制PI3K/AKT通路的激活RNA-seq分析表明，IRF8過(guò)表達(dá)的Molt4細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路顯著富集。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IRF8過(guò)表達(dá)導(dǎo)致PIK3R5下調(diào)，同時(shí)磷酸化AKT（p-AKT）和下游磷酸化的雷帕霉素靶蛋白激酶（p-MTOR）水平降低，以及CCR2蛋白水平也降低。在T-ALL小鼠模型中，Irf8-/-組的T-ALL細(xì)胞顯示PIK3R5表達(dá)增加，與AKT磷酸化增強(qiáng)一致。體內(nèi)外的救援實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PIK3R5對(duì)IRF8在T-ALL中抑制作用的重要性。圖3IRF8通過(guò)抑制PIK3R5轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制PI3K/AKT通路激活。（五）IRF8在T-ALL中被m6A相關(guān)的eraserFTO沉默基因集富集分析對(duì)T-ALL數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與RNA生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的基因集在T-ALL患者中顯著富集。同時(shí)，m6A調(diào)節(jié)劑FTO在T-ALL患者中的表達(dá)顯著高于健康供體。FTO與IRF8的關(guān)系Pearson相關(guān)性分析顯示，在兩個(gè)獨(dú)立的T-ALL隊(duì)列中，F(xiàn)TO和IRF8表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)小發(fā)夾RNA（shRNA）敲低FTO或使用FTO抑制劑FB23-2處理Molt4細(xì)胞，均可導(dǎo)致IRF8表達(dá)水平增加，同時(shí)細(xì)胞增殖受到抑制。（六）FTO通過(guò)m6A依賴機(jī)制負(fù)調(diào)控IRF8RNA-seq、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）-seq以及FTORIP-seq分析表明，F(xiàn)TO抑制劑FB23-2處理后，IRF83′非翻譯區(qū)（UTR）的m6A水平顯著增加，F(xiàn)TO結(jié)合峰在IRF8mRNA轉(zhuǎn)錄本中富集。通過(guò)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增IRF83′UTR中潛在的結(jié)合位點(diǎn)，確定了五個(gè)潛在的m6A位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型IRF83′UTR報(bào)告載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)TO通過(guò)這些m6A位點(diǎn)負(fù)調(diào)控IRF8mRNA表達(dá)。圖4FTO通過(guò)m6A劑量依賴性機(jī)制抑制IRF8。（七）FTO通過(guò)影響RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)IRF8表達(dá)RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)TO抑制劑FB23-2處理Molt4和Jurkat細(xì)胞后，IRF8轉(zhuǎn)錄本的半衰期顯著增加。在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)野生型或突變型IRF83′UTR的實(shí)驗(yàn)表明，m6A位點(diǎn)的突變顯著縮短了IRF8mRNA轉(zhuǎn)錄本的半衰期，同時(shí)MeRIP-qPCR分析證實(shí)突變降低了IRF83′UTR上的m6A水平。（八）FTO抑制劑恢復(fù)IRF8表達(dá)，抑制PI3K/AKT通路，并在體內(nèi)顯示抗白血病作用在T-ALL小鼠模型中使用FTO抑制劑FB23-2治療，在Irf8+/+組中，顯著降低了骨髓、血液和脾臟中GFP+細(xì)胞的比例，緩解了脾腫大，抑制了細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)了小鼠的生存時(shí)間。同時(shí)，免疫印跡和免疫熒光分析顯示，F(xiàn)B23-2顯著增加了骨髓和脾臟白血病細(xì)胞的IRF8表達(dá)，抑制了PIK3R5的表達(dá)和AKT的磷酸化；而在Irf8-/-組未觀察到明顯差異。綜上所述，本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)揭示了m6A修飾在T-ALL中的重要作用。FTO作為m6A修飾的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過(guò)負(fù)調(diào)控IRF8的表達(dá)促進(jìn)T-ALL的進(jìn)展。IRF8可抑制T-ALL細(xì)胞的增殖、侵襲，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控PIK3R5抑制PI3K/AKT通路的激活。FTO抑制劑能夠恢復(fù)IRF8的表達(dá)，抑制