酶的微生物生產(chǎn)工藝

27微生物酶制劑生產(chǎn)工藝27.1酶生產(chǎn)概論一、酶的定義和分類二、酶的特性三、酶的來源四、酶的生產(chǎn)菌種五、產(chǎn)酶菌株的制備和優(yōu)化27.1.1酶的定義和分類酶的定義----酶是生物體內(nèi)具有特殊催化功能的蛋白質(zhì)。酶的分類----分為6大類

1、氧化-還原酶

2、轉移酶

3、水解酶

4、裂合酶

5、異構酶

6、連接酶（合成酶）27.1.2微生物酶工業(yè)的發(fā)展概況早期應用：制曲釀酒1894年，用米曲生產(chǎn)淀粉酶作為消化藥二次世界大戰(zhàn)后，深層培養(yǎng)技術成功，酶工業(yè)快速發(fā)展：1949年深層發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶日本二十世紀50年代，糖化酶用于葡萄糖生產(chǎn)，60年代，堿性蛋白酶應用于加酶洗衣粉70年代后，酶固定化技術發(fā)展，固定?；赣糜诎被岵鸱郑潭ㄆ咸烟钱悩嬅赣糜诟吖菨{生產(chǎn)，近年來有開發(fā)了青霉素酰化酶、異淀粉酶、天冬酰胺酶目前，自然界發(fā)現(xiàn)的酶有2500多種，結晶分離的有數(shù)百種，有工業(yè)應用價值的60多種，已經(jīng)大量生產(chǎn)的只有20多種。27.1.3酶制劑的應用1、有機合成和制藥工業(yè)：酶反應與常規(guī)的化學合成結合，如延胡索酸+氨→L-天冬氨酸減少步驟，降低成本，無公害，收率高，副產(chǎn)物少。天門冬氨酸酶2、醫(yī)藥：消化酶類溶血栓酶類3、化學分析和臨床檢驗酶法分析：微量、靈敏、精確高效27.1.4酶制劑的生產(chǎn)酶的來源1、酶作為生物催化劑普遍存在于動物、植物、微生物中，可以直接從生物體中分離提純而獲得，早期酶的生產(chǎn)多是以動植物為主要原料提取而得。2、人工合成酶的方法，目前還受到試劑、設備條件的限制。3、利用動物、植物細胞和組織培養(yǎng)方法來生產(chǎn)酶，由于周期較長、成本較高，也存在一定難度。4、利用微生物生產(chǎn)酶制劑。利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點（1）能夠生產(chǎn)酶的微生物種類繁多，有較大的選擇余地。（2）微生物繁殖快、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)方法簡便，培養(yǎng)過程容易控制，（3）微生物易變異，具有較強的適應性，能夠培育出新的高產(chǎn)菌株。發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式1、固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法亦稱麩曲培養(yǎng)法，該法是利用麩皮或米糠為主要原料，另外視需要添加其它谷糠、豆餅等，加水拌成含水適度的半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基。一般適用于霉菌的生產(chǎn)。2、深層液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法是利用液體培養(yǎng)進行微生物的生長繁殖和產(chǎn)酶。根據(jù)通氣（供氧）方法的不同，又分為液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)兩種。是目前常用的方法。但無菌要求高。27.2酶合成的代謝調(diào)節(jié)及育種27.2.1酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機制，是在基因轉錄水平上進行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。

操縱子——基因表達的協(xié)同單位操縱子結構基因（編碼蛋白質(zhì),structuralgene,S）控制部位操縱基因（operatorgene,O）啟動子（promotorgene,P）（一）基因調(diào)控理論

JacobandMonod的操縱子學說（operontheory）

基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖

調(diào)節(jié)基因

啟動基因操縱基因結構基因

DNA

轉錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質(zhì)

誘導劑

控制區(qū)信息區(qū)操縱子

調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)：

可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)

（一種變構蛋白），通過與效應物(effector)（包括誘導物和輔阻遏物）的特異結合而發(fā)生變構作用，從而改變它與操縱基因的結合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。

cAMP-CRP復合物的作用示意圖

啟動基因（promotorgene）（啟動子）：有兩個位點：

（1）RNA聚合酶的結合位點（2）cAMP-CAP的結合位點。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。

只有cAMP-CRP復合物結合到啟動子的位點上，RNA聚合酶才能結合到其在啟動子的位點上，酶的合成才能開始。

操縱基因（Operatergene）:

位于啟動基因和結構基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構蛋白結合，操縱酶合成的時機與速度。結構基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應關系，其中的遺傳信息可轉錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。(二)酶合成調(diào)節(jié)的類型

1.誘導

(induction)

組成酶：細胞固有的酶類。誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶。

2.阻遏

(repression)

分解代謝物阻遏(cataboliterepression)

反饋阻遏(feedbackrepression)（三）酶合成的調(diào)節(jié)機制

1.酶合成的誘導加進某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進行。酶合成誘導的現(xiàn)象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有上述三種酶合成；（3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成。調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因關閉啟動子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（無活性）基因表達mRNAA、乳糖操縱子的結構

B、乳糖酶的誘導

乳糖阻遏蛋白（有活性）誘導

2.末端產(chǎn)物阻遏

由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現(xiàn)象：

實驗：

（1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟原則:不需要就不合成。色氨酸操縱子——酶的阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結合，使之構象發(fā)生變化與操縱基因結合，結構基因不能表達酶的誘導和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調(diào)節(jié)基因結構基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表達誘導物誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合,結構基因可以表達阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達代謝產(chǎn)物調(diào)控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結合阻遏效應舉例酶的誘導有活性－＋不轉錄，繼而不翻譯誘導物－轉錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比3.分解代謝物阻遏指細胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：

實驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”(diauxie或biphasicgrowth）。這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部位

RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)27.2.2、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選育（一勞永逸）

1.誘變育種

(1)使誘導型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜瓦x育營養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋阻遏選育結構類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏——選育抗分解代謝阻遏突變株

2.基因工程育種

（二）條件控制1.添加誘導物酶的底物類似物最有效。2.降低阻遏物濃度

除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏避免培養(yǎng)基過于豐富添加一定量的cAMP3.添加表面活性劑

離子型對細胞有毒害作用表面活性劑Tween－80

非離子型增加細胞通透性TritonX－1004.添加產(chǎn)酶促進劑27.2.3目前常用的產(chǎn)酶微生物大腸桿菌---用來生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素?；浮ⅵ?半乳糖苷酶。曲霉（黑曲霉、黃曲霉）---用來生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶?？莶輻U菌---用于生產(chǎn)a-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶。啤酒酵母---用來生產(chǎn)轉化酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶。青霉菌---用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、青霉素?；浮?`-磷酸二酯酶、脂肪酶。木霉菌---用于生產(chǎn)纖維素酶。根霉菌---用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶。鏈霉菌---用來生產(chǎn)葡萄糖異構酶。27.3產(chǎn)酶菌株的制備和優(yōu)化1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件2、菌種的分離篩選3、菌種的變異誘導技術4、原生質(zhì)體誘導實際生產(chǎn)例子1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件（1）產(chǎn)酶促進劑（2）影響酶產(chǎn)量的各種因素（3）誘導劑和抑制劑（1）產(chǎn)酶促進劑在酶制劑的生產(chǎn)過程中，如果添加少量的某種物質(zhì)就能增加酶的產(chǎn)量，則這類物質(zhì)就稱為產(chǎn)酶促進劑。產(chǎn)酶促進劑多數(shù)是酶的誘導物、或者是表面活性劑，常用的產(chǎn)酶促進劑有：（A）吐溫-80（B）脂肪酰胺磺酸鈉（C）聚乙烯醇（D）糖脂（E）乙二胺四乙酸（EDTA）（2）影響酶產(chǎn)量的各種因素A、溫度---各種產(chǎn)酶微生物對于溫度的要求是各不相同的。細菌：35-37度霉菌：30度酵母菌：30-35度B、PH值---通過掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通過添加緩沖劑、能夠控制發(fā)酵液的PH值。C、通氣量（供氧量）訖今為止，產(chǎn)酶和微生物都是需氧性的微生物。在液體深層發(fā)酵中，微生物利用的氧必須是溶解于培養(yǎng)基中和溶解氧。空氣中的氧氣---培養(yǎng)基溶解氧---透過細胞膜進入原生質(zhì)。精確測定時采用溶氧儀。D、攪拌---攪拌可將泡沫打碎、增加氧氣的溶解速度、加強了液體的湍流作用，有利于營養(yǎng)物質(zhì)與菌體細胞的接觸，促進細胞新陳代謝。E、泡沫E、泡沫酶制劑發(fā)酵過程中泡沫較多。泡沫的存在會阻止CO2的排除、同時直接影響O2的溶解。排除常常采用：機械力消泡沫法、化學消泡劑消泡沫法。常用的消泡劑有：天然油類、礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、磷酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷等等物質(zhì)。國內(nèi)酶制劑工業(yè)常用的消泡劑為：甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）泡敵（聚環(huán)氧丙烷環(huán)氧乙烷甘油醚）（3）誘導劑和抑制劑某些酶反應，當培養(yǎng)基中不存在誘導物質(zhì)時，其酶的合成就受到抑制，而當添加誘導物質(zhì)時，酶的合成就能順利進行，這類物質(zhì)稱作誘導劑。使用某些酶的抑制劑常常能夠促進酶的合成，如在多粘芽孢桿菌的培養(yǎng)基中添加淀粉酶抑制劑S-AI，能增加淀粉酶的產(chǎn)量。在酶的生產(chǎn)中，加入適量表面活性劑，也能提高酶制劑產(chǎn)量，如用爪哇真青霉生產(chǎn)纖維素酶時，如果添加0.1%的吐溫-80，則纖維素酶的產(chǎn)量可提高4倍。27.4酶類藥物的提取和純化一、生物材料的預處理（一）動物材料的預處理1、機械處理用絞肉機絞，一般細胞并不破碎。有的酶必須細胞破碎后才能有效地提取，在實驗室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。2、反復凍融

冷到-10℃左右，再緩慢溶解至室溫，如此反復多次。由于細胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細胞中顆粒及整個細胞破碎，從而使某些酶釋放出來。3、丙酮粉組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可減少酶的變性，同時因細胞結構成份的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結合的某些化學鍵打開，促使某些結合酶釋放到溶液中，常用的方法是將組織糜或勻漿懸浮于0.0lmol／L，pH6.5的磷酸緩沖液中，在0℃下一邊攪拌，一邊徐徐倒入10倍體積的-15℃無水丙酮內(nèi)，10分鐘后，離心過濾取其沉淀物，反復用冷丙酮洗幾次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低溫下可保存數(shù)年。（二）微生物的預處理要是酶是胞外酶，則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對胞內(nèi)酶則需將菌體細胞破壁，制成無細胞的懸液后再行提取。菌體用生理鹽水洗滌除去培養(yǎng)基后，應深凍保存。干燥法，因為干燥常能導致細胞自溶，增加酶的釋放，從而在后處理中破壁不必太劇烈就能達到預期目的。

1、干燥法：

①空氣干燥25～30℃

②真空干燥還原劑作保護劑(如谷胱甘肽）

③冷凍干燥對較敏感的酶宜用此法。

2、機械法：常用的方法有研磨法，組織勻漿法，超聲波法，高壓勻漿法等。3、酶法處理用得最多的是溶菌酶，用量為細胞壓積重的1/1000.如在37℃，pH8.0下對小球菌進行破壁處理，歷時15分鐘，即可提取核酸酶。也有用脫氧核糖核酸酶處理，操作與溶菌酶同。二、酶的提取1、水溶液法常用稀鹽溶液或緩沖液提取。一般在低溫下操作。在酸性條件下穩(wěn)定的酶要在酸性條件下提取。一般來說，堿性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用堿性溶液提取。鹽濃度一般以等滲為好，相當于0.15mol／LNaCl的離子強度是最適宜于酶的提取。2、有機溶劑法某些結合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結合，為此必須除去結合的脂質(zhì)，且不能使酶變性，最常用的有機溶劑是丁醇。丁醇的特性：a親脂性強，b兼具親水性。C在脂與水分子之間起類似去垢劑的作用。丁醇提取方法：一是均相法，少量丁醇，攪拌均勻，提取較長時間，離心，取下層液相。二是二相法，適用于易在水溶液中變性的酶。方法是每克組織干粉或干菌體用丁醇5毫升，攪拌20分鐘，離心，取沉淀。

3、表面活性劑法表面活性劑能與蛋白質(zhì)結含而分散在溶液中，故可用于提取結合酶。三、酶制劑的工業(yè)提取法（一）發(fā)酵液的預處理及過濾微生物發(fā)酵液的分離，過濾，發(fā)酵液中加絮凝劑或凝固劑。絮凝劑有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸。（二）酶液的脫色活性炭、脫色樹脂。（三）鹽析法用得最多的是（NH4）2SO4，在常溫下不會造成酶的失活，若分級沉淀應用得當，雜蛋白雜質(zhì)也較少。（四）有機溶劑法

有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的能力為丙酮＞異丙醇＞乙醇＞甲醇。工業(yè)上通常采用乙醇作為沉淀劑。（五）噴霧干燥直接制備粉末酶制劑噴霧干燥用于干燥菌體，藥用酶常用冷凍干燥。四、酶的純化評價純化工藝主要看二個指標，一是酶比活，二是總活力回收。

酶在純化過程中的一些技術難點：（一）雜質(zhì)的除去酶提取液中，除所需酶外，還含有大量的雜蛋白、多糖、脂類和核酸等。（1）pH和加熱沉淀法

（2）蛋白質(zhì)表面變性法利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可除去雜蛋白，加入氯仿和乙醇進行震蕩，可以除去雜蛋白。（3）選擇性變性法

利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸處理。（4）核酸沉淀劑法用核酸酶，將核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于離心分離。用核酸沉淀劑如三甲基十六烷基溴化銨、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚精蛋白和二氯化錳等。（5）將酶與底物結合酶和底物結合或競爭性抑制劑結合后，熱穩(wěn)定性大大提高，這樣就可用加熱法除去雜蛋白。（二）脫鹽和濃縮1、脫鹽脫鹽方法是透析和凝膠過濾。2、濃縮酶的濃縮方法很多，有冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚乙二醇吸水等。（三）酶的結晶把酶提純到一定純度以后（通常純度應達50%以上），可使其結晶，酶的純度經(jīng)常有一定程度的提高。為研究蛋白質(zhì)空間結構提供X射線衍射樣品。1、酶的結晶方法酶的結晶方法主要是緩慢地改變酶蛋白的溶解度，使其略處于過飽和狀態(tài)。（1）鹽析法

操作要在低溫下進行，加鹽，緩沖液pH要接近酶的等電點。多數(shù)酶就可形成結晶。有時也可交替置在4℃冰箱中和室溫下來形成結晶。（2）有機溶劑法

酶液中滴加有機溶劑，有時也能使酶形成結晶。一般要含少量無機鹽的情況下，選擇使酶穩(wěn)定的pH，緩慢地滴加有機溶劑。使用的緩沖液一般不用磷酸鹽，而用氯化物或乙酸鹽。（3）復合結晶法有時可以利用某些酶與有機化合物或金屬離子形成復合物或鹽的性質(zhì)來結晶。（4）透析平衡法（5）等電點法2、結晶條件的選擇（1）酶的純度酶的純度越高，結晶越容易，長成大的單晶可能性也越大。結晶對酶有明顯的純化作用。（2）酶的濃度（3）溫度結晶的溫度通常在4℃下或室溫25℃下，低溫條件下酶不僅溶解度低，而且不易變性。（4）時間結晶形成的時間,數(shù)小時到幾個月，有的甚至需要1年或更長時間。一般來說，較大而性能好的結晶是在生長慢的情況下得到的。一般希望使微晶的形成快些，然后慢慢地改變沉淀條件，再使微晶慢慢長大。（5）pH

調(diào)整pH可使結晶長到最佳大小，也可改變晶形。結晶溶液pH一般選擇在被結晶酶的等電點附近。（6）金屬離子

許多金屬離子能引起或有助于酶的結晶，在酶的結晶過程中常用金屬離子有Ca2+、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ni2＋等。（7）晶種

不易結晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種才能結晶，（8）結晶器皿處理

結晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用結晶母液再沖洗一次。結晶的玻璃器皿，可用硅涂料進行表面處理，以使表面光滑且不潤濕。這樣可減少晶核數(shù)目，形成大的結晶。（四）酶分離和純化工作的注意事項1、防止酶蛋白變性2、防止輔因子的流失3、防止酶被蛋白水解酶降解

27.5酶類藥物

一、藥用酶類的概述早期酶制劑主要用于治療消化道疾病，燒傷及感染引起的炎癥疾病，現(xiàn)在國內(nèi)外己廣泛應用于多種疾病的治療，其制劑品種已超過700余種。（一）促進消化酶類

（二）消炎酶類

（三）與纖維蛋白溶解作用有關的酶類（四）抗腫瘤的酶（五）其它藥用酶（一）胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）

胃蛋白酶廣泛存在于哺乳類動物的胃液中，藥用胃蛋白酶系從豬、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。1、組成（結構）、性質(zhì)藥用胃蛋白酶是胃液中多種蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶等，為粗制的酶制劑。水溶液呈酸性，難溶于乙醇、氯仿等有機溶劑。

pI為pH1.0，最適pH1.5～2.0?？扇苡?0％乙醇和pH4的20％乙醇中。胃蛋白酶能水解大多數(shù)天然蛋白質(zhì)底物。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：

胃蛋白酶原鹽酸催化激活成胃蛋白酶。常用的脫脂劑有乙醚、氯仿、四氯化碳。（2）工藝過程：（3）胃膜素和胃蛋白酶聯(lián)產(chǎn)工藝：向經(jīng)消化、提取、脫脂、分層、濃縮及60％丙酮沉淀分離胃膜素的母液中，邊攪拌邊加冷丙酮，至比重為0.91，即有淡黃色胃蛋白酶沉出，靜放過夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。（4）結晶胃蛋白酶的制備：藥用胃蛋白酶原粉，溶于20％酒精中，加H2SO4調(diào)pH3.0，5℃靜置20h后過濾，加硫酸鎂至飽和，進行鹽析。鹽析物再在pH3.8～4.0的乙醇中溶解，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8～2.0，即析出針狀胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4的乙醇中，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8，在20℃放置，可得板狀或針狀結晶。（二）胰蛋白酶胰蛋白酶是從牛、羊胰臟提取、結晶的凍干制劑。易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機溶劑。在pH1.8時，短時煮沸幾乎不失活；在堿溶液中加熱則變性沉淀，Ca2+有保護和激活作用，胰蛋白酶的pI為10.1。

牛胰蛋白酶在腸激酶或自身催化下，釋放出6肽，變成有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶分子量24000，由223個氨基酸殘基組成。

胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所組成的肽鍵。酶本身很容易自溶。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：（三）糜蛋白酶（Chymotrypsin，EC3.4.4.5）胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成α-糜蛋白酶。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：（2）工藝過程：

酶原加少量胰蛋白酶，pH7.6（四）尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）尿激酶，是一種堿性蛋白酶。由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動物的尿中。人尿平均含量5～6國際單位／m1。1、組成（結構）性質(zhì)（1）尿激酶有多種分子量形式。尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性條件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶降解成為尿激酶。（2）尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，血纖維蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白質(zhì)底物，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵使纖溶酶原轉為纖溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。（3）尿激酶的pI為pH8～9，主要部分在pH8.6左右。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，凍干狀態(tài)可穩(wěn)定數(shù)年。加入1％EDTA、人血白蛋白或明膠可防止酶的表面變性作用。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：（2）工藝過程：硅藻土吸附，0.02％氨水加0.1mol／L氯化鈉洗脫。QAE—Sephadex層析柱去熱原、色素。CM—C濃縮。

（五）細胞色素C（CytochromeC）細胞色素C存在于自然界中一切生物細胞里，其含量與組織的活動強度成正比。以哺乳動物的心肌、鳥類的胸肌和昆蟲的翼肌含量最多，肝、腎次之，皮膚和肺中最少。

1、組成（結構）、性質(zhì)

細胞色素C是含鐵卟啉的結合蛋白質(zhì)，鐵卟啉環(huán)與蛋白質(zhì)部分比例為1∶1。豬心細胞色素C分子量12200。pI為pH10.2～10.8。細胞色素C對干燥、熱和酸都較穩(wěn)定。氧化型呈水溶液深紅色，在飽和硫酸銨中可溶解。

還原型水溶液呈桃紅色，溶解度較小。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：人造沸石pH7.5吸附，蒸餾水和氯化鈉溶液反復洗滌，25％硫酸銨溶液洗脫。20％三氯醋酸沉淀細胞色素C，AmberliteIRC－50（NH4＋）樹脂柱吸附。（六）溶菌酶（Lysozyme）

溶菌酶，又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。它廣泛存在于鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、尿、乳汁、白細胞和組織（如肝、腎）細胞內(nèi)，其中以蛋清含量最豐富。溶菌酶是一種具有殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗炎癥。1、組成（結構）和性質(zhì)溶菌酶是一堿性球蛋白，分子中堿性氨基酸、酰氨殘基及芳香族氨基酸（如色氨酸）比例很高。溶菌酶能催化粘多糖或甲殼素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵。溶菌酶是一種罕見的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。在pH5.5加熱4h后，酶變得更活潑。低濃度的Mn（10-7mol／L）在中性和堿性條件下能使酶免受熱的失活作用。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線（七）L-天門冬酰胺酶（L-asparaginase）1、組成（結構）、性質(zhì)

L-天門冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是從大腸桿菌菌體中提取分離的酶類藥物，用于治療白血病。性狀呈白色粉末狀，微有濕性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。最適pH8.5，最適溫度37℃。

L-天門冬酰胺酶的產(chǎn)生菌是霉菌和細菌，故可作制造酶的原料。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：（八）激肽釋放酶（Kallikrein）

激肽釋放酶是一種蛋白酶。哺乳動物的激肽釋放酶有兩大類：血液激肽釋放酶和組織激肽釋放酶。藥用激肽釋放酶又稱血管舒緩素，主要來自頜下腺或胰腺。豬胰激肽釋放酶是一種糖蛋白，含有唾液酸，在腺體中以酶原形式存在。唾液酸的除去并不影響酶的活性。（1）專一性激肽釋放酶是一種內(nèi)切蛋白水解酶，當它作用于蛋白質(zhì)底物激肽原后釋放出激肽。激肽釋放酶只作用于天然激肽原。（2）穩(wěn)定性一般說，激肽釋放酶的純度越高，穩(wěn)定性越差。在水溶液中不穩(wěn)定，但在pH8.0的水或緩沖液中，可在冷凍狀態(tài)下保存相當長時間不失活。

2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：（2）工藝過程：冷丙酮33％、70％，用丙酮、乙醚脫脂、脫水。40%、60%冷丙酮分級沉淀。弱酸性陽樹脂AmberliteCG－50（鈉型）（九）超氧化物歧化酶（Superoxide

dismutaseSOD）超氧化物歧化酶是一種重要的氧自由基清除劑，作為藥用酶在美國、德國、澳大利亞等國有產(chǎn)品，此酶屬金屬酶，它催化的化學反應是：