人體肌肉干細胞分離制備規(guī)范

Q/LB.□XXXXX-XXXXT/XXXXXXX—XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義、縮略語 14基本要求 25樣本采集 36樣本運輸 47樣本接收 48分離與培養(yǎng) 59記錄 610質(zhì)量控制 711質(zhì)量評價與放行 8附錄A（資料性）人體肌肉干細胞質(zhì)量控制檢測表 10參考文獻 11前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由重慶市鉑而斐細胞生物技術(shù)有限公司提出。本文件由中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進會歸口。本文件起草單位：重慶市鉑而斐細胞生物技術(shù)有限公司、山東卓東生物科技有限公司、濟南萬泉生物技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：甘元善、牟曉東、戴曉宇。人體肌肉干細胞分離制備規(guī)范范圍本文件規(guī)定了人體肌肉干細胞的基本要求、樣本采集、樣本運輸、樣本接收、分離與培養(yǎng)、記錄、質(zhì)量控制、質(zhì)量評價與放行。本文件適用于人體肌肉干細胞的分離制備與質(zhì)量控制。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標準GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T37864生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范GB50346生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范GB50591潔凈室施工及驗收規(guī)范術(shù)語和定義、縮略語術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。人體肌肉干細胞humanmuscle-derivedstemcells從人體肌肉組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。供者donor提供用于細胞產(chǎn)品生產(chǎn)用細胞的個體，可以是健康人，也可以是患者。樣本specimen在特定時間從受試者或捐獻者中采集的器官、組織等標本。質(zhì)量控制qualitycontrol為達到臨床級人源干細胞入庫質(zhì)量要求所采取的操作技術(shù)和管理程序。細胞活率cellviability能夠增值、保持正常代謝活性的細胞占全部細胞的百分比。臺盼藍trypanblue細胞活性染料，常用于檢測細胞膜的完整性，檢測細胞是否存活?；罴毎蚣毎そY(jié)構(gòu)完整會排斥臺盼藍，而喪失活性或者細胞膜結(jié)構(gòu)不完整的細胞則會被臺盼藍染成淡藍色。放行檢驗releasetesting在干細胞已完成質(zhì)量檢驗的基礎(chǔ)上，對每種類型的每批次干細胞，在凍存入庫及出庫前所進行的相對快速和簡化的檢驗?？s略語下列縮略語適用于本文件。HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HTLV：人類嗜T細胞病毒(HumanThymicLeukemiaVirus)EBV：人類皰疹病毒（Epstein-barrVirus）CMV：巨細胞病毒（cytomegalovirus）基本要求場地與設(shè)施人體肌肉干細胞制備機構(gòu)的場地和設(shè)施應(yīng)滿足以下要求：選址應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，空氣質(zhì)量標準應(yīng)符合GB3095標準分級二級標準；實驗室或廠房應(yīng)由具有潔凈實驗室設(shè)計建設(shè)資質(zhì)的工程公司設(shè)計與建造，并應(yīng)符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的規(guī)定。建設(shè)完成后，各功能區(qū)域的潔凈級別應(yīng)由專業(yè)機構(gòu)進行檢測并出具合格證明；各功能區(qū)應(yīng)按肌肉干細胞制備工藝進行各區(qū)域設(shè)計，符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》的要求。應(yīng)配備獨立質(zhì)量檢測實驗室，并符合GB19489和GB50346的規(guī)定。設(shè)備和耗材人體肌肉干細胞制備機構(gòu)的設(shè)備和耗材應(yīng)滿足以下要求：應(yīng)優(yōu)先選用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，獲得國家資質(zhì)認證的設(shè)備、儀器、耗材和試劑；應(yīng)對設(shè)備、儀器、耗材和試劑供應(yīng)商進行資質(zhì)審核認證，要求供應(yīng)商提供產(chǎn)品質(zhì)量報告和批次檢驗報告，并對耗材及試劑進行質(zhì)量抽檢，避免采購質(zhì)量不合格的產(chǎn)品；設(shè)備和儀器正式使用前應(yīng)做安裝確認(IQ)、運行確認（OQ）和性能確認(PQ)，并定期進行第三方校準，不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細胞制品；應(yīng)對設(shè)備與儀器進行編號建檔，并建立標準操作流程(SOP)，確保使用、運行、保養(yǎng)、維修記錄完整可追溯，對于關(guān)鍵工藝相關(guān)設(shè)備參數(shù)應(yīng)進行實時監(jiān)測，及時對狀態(tài)異常的設(shè)備進行校對和維修。人員管理人體肌肉干細胞制備機構(gòu)人員管理應(yīng)滿足以下要求：應(yīng)分別設(shè)立干細胞制備負責(zé)人、質(zhì)量管理負責(zé)人和質(zhì)量授權(quán)人崗位。由法人授權(quán)任命，任職資質(zhì)應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，定期接受崗位專業(yè)培訓(xùn)，制備負責(zé)人與質(zhì)量管理負責(zé)人、質(zhì)量授權(quán)人不得相互兼任；干細胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員應(yīng)具備的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的抗體檢測應(yīng)為陰性，并且(矯正)視力正常，無色盲、色弱；干細胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員應(yīng)半年接受體檢一次，有呼吸道感染或發(fā)熱等疾病狀態(tài)下不得進入潔凈操作區(qū)，需完全康復(fù)后方可恢復(fù)崗位操作；干細胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員上崗前應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，內(nèi)容包括但不限于干細胞理論與實踐、生命倫理、干細胞法律法規(guī)、GMP管理、GCP資質(zhì)、制劑基本知識、細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)、生物安全、儀器設(shè)備使用與維護方法、物料管理與清潔衛(wèi)生、崗位職責(zé)、操作規(guī)范等內(nèi)容。樣本采集一般要求人體肌肉樣本采集與處理應(yīng)符合GB/T37864的要求。采集和處理程序可供樣本采集人員使用。人體肌肉樣本采集方應(yīng)具備相關(guān)的資質(zhì)和設(shè)施環(huán)境。人體肌肉樣本采集應(yīng)通過倫理審查批準并履行知情同意程序，應(yīng)建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量管理體系確保符合用戶需求并持續(xù)改進。供者健康人體肌肉樣本采集方應(yīng)對供者的基本信息與健康信息進行詳細采集與記錄，同時做好對供者的隱私保護，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。供者應(yīng)無血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤史、性傳播疾病及高危人群史、吸毒史，不應(yīng)具有包括但不限于以下疾病或健康狀況：一般傳染性疾病或其他遺傳疾病：HIV、HBV、HCV、梅毒、HTLV、EBV與CMV抗體與核酸檢測應(yīng)為陰性；傳染性皮膚病(未治愈的)；大面積皮膚損傷(未治愈的)；鼻/咽喉傳染病(未治愈的)。采集前12個小時內(nèi)用過酒精，鎮(zhèn)靜藥等。采集場所人體肌肉的采集場所應(yīng)達到Ⅲ級潔凈手術(shù)室要求。采集人員采集人員應(yīng)具有醫(yī)師職業(yè)證，且經(jīng)過相應(yīng)的技術(shù)培訓(xùn)。采集流程信息填寫采集人員應(yīng)按照要求填寫個人信息，個人信息表應(yīng)包括但不限于：姓名、性別、有效身份證件、聯(lián)系方式、緊急聯(lián)絡(luò)人、住址等。采集人員在采集前填寫健康調(diào)查表。采集前準備肌肉組織采集前應(yīng)由醫(yī)師制定手術(shù)方案和術(shù)前術(shù)后的防感染措施。應(yīng)確定供者身體健康，精神狀態(tài)良好，保持供者的血壓、血糖控制在較好的范圍內(nèi)。采集前的三天內(nèi)應(yīng)停用抗凝藥、激素、阿司匹林、維生素E等。采集術(shù)前兩天應(yīng)清淡飲食，合理安排作息時間。采集前應(yīng)對客戶進行身體檢查，包括但不限于：病毒全套、血常規(guī)、凝血系列、心電圖等。耗材器械確認采集人員應(yīng)按照采集套裝清單核查器材種類和數(shù)量，一次性使用物品在有效期內(nèi)且包裝完好。手術(shù)前應(yīng)對采集器材進行復(fù)核，復(fù)核內(nèi)容主要包括：手術(shù)包：無破損、無滲漏、無污染，處于有效期內(nèi)；消毒劑：一般選用含碘消毒液，對碘過敏者可選用其他消毒劑；應(yīng)處于有效期內(nèi)；應(yīng)標明啟用日期；采集容器上均已粘貼供者識別碼。采集過程由醫(yī)師行肌肉切取手術(shù)，置于無菌采集瓶中，密封保存，并粘貼條形碼作為唯一標識。采集后注意事項采集后盡量平躺休息60分鐘，盡量減少肢體運動。采集后一周建議溫水擦浴，傷口不要碰水。采集后三天內(nèi)禁止飲酒，飲食以清淡為主。保持心情舒暢，合理飲食，作息時間規(guī)律。特殊情況（如感染、血腫、疼痛等）及時復(fù)診。樣本運輸一般要求樣本運輸人員應(yīng)是經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)合格的人員，對樣本運輸應(yīng)制定規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，并對樣本運輸全程做記錄，包括但不限于運輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時間、人員、地址及樣本信息，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。樣本運輸應(yīng)采用平穩(wěn)、安全、快速的運輸途徑，宜采用冷藏運輸車或?qū)Ｓ脴吮纠洳剡\輸箱運輸。運輸過程中應(yīng)防滲漏、防輻射、抗震動、耐壓、耐熱等，樣本包裝應(yīng)貼上條形碼作為唯一標識。樣本運輸溫度應(yīng)維持在2℃～8℃，運輸時間不超過12小時。運輸箱運輸箱應(yīng)有相應(yīng)的標識，標識內(nèi)容應(yīng)完整、清晰，標識至少包括以下內(nèi)容：——采集方名稱及聯(lián)系方式；——最大承重量；——放置方向、防摔、防曬、防雨標識；——最多疊放層數(shù)；——樣本的品名、運輸起始地和目的地、樣本保存溫度；——生物危害標識；——禁止輻射標識。質(zhì)量監(jiān)控樣本運輸過程中應(yīng)有可供追溯的記錄，記錄應(yīng)包括下列內(nèi)容：品名、數(shù)量、規(guī)格；狀態(tài)是否正常；運輸?shù)氖及l(fā)地和目的地；采集機構(gòu)交接人、時間和日期；運輸承接人、時間和日期；運輸方式和運輸箱編號及溫度狀態(tài)；運輸箱的外觀和標識是否完整。運輸前應(yīng)檢查冷藏運輸箱及控溫設(shè)備的性能和運行狀態(tài)是否符合要求。運輸設(shè)備應(yīng)定期進行監(jiān)控和評估：溫度：隨機抽取運輸箱進行腔體空載和滿載條件下的測定，確認其滿足性能要求；微生物：對箱體的內(nèi)壁進行取樣開展微生物培養(yǎng)，不得檢出致病性的微生物。運輸過程的記錄應(yīng)放入樣本檔案，保存至樣本使用或銷毀后10年以上。樣本接收樣本接收人員應(yīng)是經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)合格的人員，應(yīng)遵從安全與準確的原則對樣本接收制定規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，并對樣本接收過程進行記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。樣本接收時，接收人員應(yīng)做好自我防護工作，接觸樣本之前應(yīng)佩戴手套與口罩，并對接收場所進行消毒。接收樣本后應(yīng)先觀察樣本容器外包裝的外觀，檢查有無破損。檢查外觀后，工作人員應(yīng)檢查樣本采集信息記錄表是否齊全，同時確認記錄表上信息是否填寫完整，檢查信息記錄表信息是否與樣本信息一一對應(yīng)，樣本及記錄表上應(yīng)貼有一致對應(yīng)的條形碼，做到樣本與供者信息相對應(yīng)，確認無誤后進行接收。樣本接收后，使用75%醫(yī)用酒精消毒清理容器外表面，如不能及時對樣本進行處理，需把樣本保存在2℃～8℃條件下，最長時間不超過12小時。樣本量應(yīng)能夠滿足制備和檢測的最低要求。樣本接收后應(yīng)及時將信息反饋給樣本發(fā)送方。制備機構(gòu)應(yīng)制定樣本拒收標準，按照樣本拒收標準處理樣本。分離與培養(yǎng)基本要求人體肌肉干細胞分離與培養(yǎng)應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨慶前研究指導(dǎo)原則》要求的車間內(nèi)進行。所有操作應(yīng)事先制定標準規(guī)范，由經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員嚴格遵照執(zhí)行，并進行記錄登記，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。分離與培養(yǎng)過程中應(yīng)標識干細胞的名稱、代次、批次、操作日期、培養(yǎng)條件、操作人員姓名等信息。所使用試劑應(yīng)采用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《中華人民共和國藥典》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求的藥品輔料或已獲批的藥品，應(yīng)出具產(chǎn)品質(zhì)檢合格報告，并對各批次試劑進行質(zhì)量抽檢。應(yīng)避免人源或動物源性血清及蛋白，不得使用同種異體人血清或血漿。如必須使用動物血清，應(yīng)確保其無特定動物源性病毒污染。嚴禁使用海綿體狀腦病流行區(qū)來源的牛血清。分離前準備工作環(huán)境確認：潔凈室和潔凈工作臺或生物安全柜應(yīng)使用紫外燈滅菌30分鐘，并啟動凈化風(fēng)機和空調(diào)系統(tǒng)自凈20分鐘以上。工作人員核對樣本與采集信息內(nèi)容一致性，用75%的乙醇對采集瓶外表面自下而上進行清潔消毒，并放置傳遞窗自凈15分鐘后，傳入分離、處理區(qū)域。物料準備：取出所需的試劑及耗材放置物料推車上，放置于潔凈化工作臺或生物安全柜旁邊，待用。核查確認所用試劑及耗材的批號及是否在有效期內(nèi)。培養(yǎng)液準備：自配培養(yǎng)液使用前確認微生物培養(yǎng)72小時以上結(jié)果為陰性；商品化的細胞培養(yǎng)液使用前應(yīng)核查確認合格證和有效期。分離與培養(yǎng)方法將肌肉組織剪碎至糜狀，以膠原酶、中性酶和胰酶消化法分離原代細胞，采用貼壁法（膠原蛋白包埋的培養(yǎng)板）進行人肌肉間充質(zhì)干細胞（鐵壁快，24小時之內(nèi)）和肌肉干細胞（貼壁慢，48小時之后)的分離。細胞換液換液操作應(yīng)嚴格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無外源微生物污染，相關(guān)操作均進行記錄并入檔保存至少30年。換液時間及頻次應(yīng)根據(jù)肌肉干細胞生長情況及培養(yǎng)基狀態(tài)進行判斷，以保障肌肉干組胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)水平，并消除代謝物毒害作用。換液操作時吸棄培養(yǎng)瓶中原有的部分或全部培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液。首次換液需要在鏡下觀察到原代細胞完全貼壁和延展后方可進行。培養(yǎng)基成分應(yīng)符合肌肉干細胞分離與培養(yǎng)基本要求，盡量采用已獲國家批準的臨床級產(chǎn)品或藥品輔料。細胞傳代傳代操作應(yīng)嚴格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無外源微生物污染，相關(guān)操作均進行記錄并入檔保存至少30年。一般情況在達到65%～80%融合度可講行傳代操作，傳代操作應(yīng)密度適宜、及時，迅速。傳代所使用消化酶應(yīng)符合肌肉干細胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國家已批準的臨床級產(chǎn)品。如必須使用動物源性消化酶，應(yīng)確保其無特定動物源性病毒污染。細胞凍存凍存操作應(yīng)嚴格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無外源微生物污染，相關(guān)操作均進行記錄并入檔保存至少30年。經(jīng)制備數(shù)量達到凍存要求的肌肉干細胞系可進行凍存操作，凍存細胞應(yīng)加入適當(dāng)?shù)膬龃姹Ｗo液，遵循程序降溫原則，并在液氮中進行保存。凍存液成分應(yīng)符合肌肉干細胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國家已批準的臨床級產(chǎn)品或藥品輔料，二甲基亞砜含量不得超過10%，如必須使用動物源性血清，應(yīng)確保其無特定動物源性病毒污染，嚴禁使用海綿狀腦病流行區(qū)來源的牛血清。凍存細胞應(yīng)標明干細胞名稱、培養(yǎng)條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯一標識。液氮凍存應(yīng)使用符合要求的液氮容器，氣相凍存，由專人負責(zé)，保證液氮充足，溫度恒定。穩(wěn)定性考察細胞庫應(yīng)依據(jù)儲存的干細胞產(chǎn)品的特性，制定年度的儲存細胞質(zhì)量穩(wěn)定性考察方案和計劃，并制定穩(wěn)定性考察的相關(guān)質(zhì)量標準。穩(wěn)定性考察的相關(guān)質(zhì)量標準包括但不限于以下內(nèi)容：凍存容器完整性和密閉性；細胞活率；微生物培養(yǎng)；細胞凍存復(fù)蘇回收率；細胞表面標記物表達；細胞生物學(xué)效力。肌肉干細胞在凍存后1周復(fù)蘇存活率不應(yīng)低于80%，1年復(fù)蘇存活率不應(yīng)低于60%。常規(guī)每年至少執(zhí)行一次穩(wěn)定性考察計劃，如遇特殊情況（例如液相液氮罐故障）可臨時性增加穩(wěn)定性考察計劃。應(yīng)對年度性的穩(wěn)定性考察結(jié)果進行趨勢分析，便于監(jiān)測細胞儲存的連續(xù)穩(wěn)定性并改進細胞儲存工藝。記錄原始記錄應(yīng)確保其可追溯細胞分離、處理和儲存操作所有環(huán)節(jié)，記錄內(nèi)容包含但不限于以下信息：供者身份號碼；產(chǎn)品描述碼、采集類型和分類碼；產(chǎn)品名稱和組分；供者唯一身份辨識符，如果適用；采集日期和時間；生產(chǎn)制備機構(gòu)的名稱和地址；制備、保存、凍存中關(guān)鍵步驟的細節(jié)及結(jié)果；關(guān)鍵步驟的日期和時間，如果適用；每一步驟的操作人員姓名；在分離、處理、凍存、儲存過程中使用的關(guān)鍵物料的名稱、生產(chǎn)商、批號、有效期限；使用試劑的數(shù)量；使用設(shè)備編碼。記錄的審核：應(yīng)對記錄的準確性和完整性以及標準、法律法規(guī)的符合性進行審核。記錄的保存：記錄應(yīng)歸檔于受控區(qū)域進行保存，確保整個保存期間記錄的清晰和完整性，并應(yīng)避免意外或非授權(quán)的調(diào)閱、丟失、損壞、破壞、混淆或篡改。記錄的修改：機構(gòu)應(yīng)建立并保持合適的記錄修改程序。記錄修改人的簽名及日期應(yīng)記錄下來；修改前的記錄內(nèi)容應(yīng)清晰可辨認。隱私保護：應(yīng)建立保密機制，確保供者、員工信息的保密性。記錄保存期限：文件記錄是要保存至細胞應(yīng)用或處理后20年。質(zhì)量控制質(zhì)控內(nèi)容人體肌肉干細胞安全性人體肌肉干細胞安全性檢驗項目包括：無菌檢測：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1101無菌檢測法執(zhí)行，對肌肉干細胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測。細菌和真菌檢測結(jié)果都應(yīng)為陰性；支原體檢測：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3301支原體檢測法執(zhí)行，對肌肉干細胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測。支原體檢測結(jié)果都應(yīng)為陰性；細胞內(nèi)外源致病因子檢測：采用血清ELISA檢測法或核酸檢測法，對肌肉干細胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液、細胞等）檢測。HIV抗體、HBsAg、HCV抗體、TP抗體、CMV-IgM、HTLV抗體、HPV抗體、HHV抗體、EBV抗體檢測應(yīng)為陰性；HCV、HBV、HIV病毒核酸檢測應(yīng)為陰性；內(nèi)毒素檢測：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢測法執(zhí)行，對肌肉干細胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測。各類樣本中的內(nèi)毒素檢測值應(yīng)≤0.5EU/mL。致瘤性檢測：采用免疫缺陷動物（裸鼠或SCID鼠），通過局部或靜脈方式接種肌肉干細胞，評價肌肉干細胞致瘤性。體內(nèi)致瘤試驗嚴格遵照動物倫理要求執(zhí)行，單只小鼠接種肌肉干細胞數(shù)量≥106細胞/kg，觀察期≥12周。肌肉干細胞應(yīng)無致瘤性。人體肌肉干細胞穩(wěn)定性人體肌肉干細胞穩(wěn)定性檢測項目包括：細胞數(shù)量和活率檢測：選用血球細胞計數(shù)板或細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，將待檢測細胞使用臺盼藍或A0/PI熒光染料染色，讀取細胞數(shù)并計算活率。各代數(shù)及批次肌肉干細胞活細胞比例≥90%。生長活性檢測：通過檢測細胞倍增時間、細胞周期、克隆形成率以及端粒酶活性對肌肉干細胞生長活性進行測定，各代數(shù)及批次肌肉干細胞應(yīng)處于指數(shù)生長期，GO期細胞數(shù)≤10%，具有端粒酶活性。細胞純度和均一性檢測：采用肌肉干細胞表面標志物流式檢測以及人基因組DNA短片段重復(fù)序列(STR)測序進行檢定。各代數(shù)及批次肌肉干細胞表面標志物表達應(yīng)符合流式檢測比例要求，單一細胞系的肌肉干細胞各代次及批次細胞STR檢測結(jié)果應(yīng)保持一致。人體肌肉干細胞生物學(xué)特征人體肌肉干細胞生物學(xué)特征檢測項目包括：細胞形態(tài)檢測：顯微鏡下觀察，肌肉干細胞貼壁生長，呈短梭形外觀，形態(tài)均一，細胞之間無密切接觸；細胞表面標志物檢測：采用流式細胞術(shù)進行測定，肌肉干細胞表面標志物Integrinα7、Notch1和細胞核內(nèi)標志物Pax7、myogenin陽性率不低于95%；CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105陽性率不高于5%。分化能力檢測：采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，肌肉干細胞應(yīng)能夠分化為成肌肉、脂肪、骨、軟骨細胞。成肌分化經(jīng)觀察多核的肌管的形成鑒定，成脂分化經(jīng)油紅0染色法鑒定，成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定，成軟骨分化經(jīng)阿爾辛藍染色法鑒定。染色體核型檢測：采用G帶分析法進行測定，肌肉干細胞染色體數(shù)量為46(含XX/XY)，無染色體缺失、異位和重排現(xiàn)象。質(zhì)控分類批次質(zhì)量檢驗人體肌肉干細胞制備機構(gòu)應(yīng)對由同一供體、同一時間、使用同一工藝采集和分離獲得的干細胞進行例行批次質(zhì)量檢驗。當(dāng)制備工藝、耗材、試劑、場地或規(guī)模等條件發(fā)生時，制備機構(gòu)應(yīng)對多批次干細胞制劑進行質(zhì)量檢驗，確保工藝和質(zhì)量穩(wěn)定合格，記錄入檔保存至少30年。質(zhì)量控制檢測表參見附錄A。放行質(zhì)量檢驗每一批次肌肉干細胞制劑在臨床使用前應(yīng)在完成例行質(zhì)量檢驗的基礎(chǔ)上，由干細胞臨床研究機構(gòu)質(zhì)檢平臺進行快速和簡化的質(zhì)量檢測，應(yīng)包括但不限于活率、細胞表型、細菌、病毒、支原體和內(nèi)毒素含量等，確認細胞合格后方可申請臨床放行使用。相關(guān)記錄報告應(yīng)入檔保存至少30年。復(fù)核質(zhì)量檢驗人體肌肉干細胞制備機構(gòu)應(yīng)對每一批次干細胞制劑單獨留樣保存，詳細記錄批號、代次、生產(chǎn)日期、來源等信息。定期由國家或地方相關(guān)部門授權(quán)的專業(yè)細胞檢驗機構(gòu)或?qū)嶒炇疫M行肌肉干細胞制劑的質(zhì)量復(fù)核檢驗，并出具檢驗報告，入檔保存至少30年。復(fù)核質(zhì)量檢驗報告出具時間應(yīng)在該批次肌肉干細胞制劑提出放行申請之前，并作為放行檢驗參考。質(zhì)量評價與放行質(zhì)量評價內(nèi)容供者健康篩查結(jié)果應(yīng)符合合格供者要求并簽署了知情同意書。肌肉及檢測標本的采集和運輸符合標準要求。肌肉及檢測標本的接收、標識以及暫存符合標準要求。細胞分離、處理、檢測區(qū)域應(yīng)滿足操作要求，有潔凈要求的操作環(huán)境應(yīng)滿足相應(yīng)級別環(huán)境要求，應(yīng)有定期環(huán)境監(jiān)控；細胞分離、處理各工序完畢后均應(yīng)及時清場；現(xiàn)場應(yīng)無污染及交叉污染，如有傳染病原體或污染物，應(yīng)得到有效隔離或清除。細胞在分離、處理及檢測等過程中所涉及的人員均已通過考核合格后上崗。細胞分離、處理、檢測等所使用的設(shè)備應(yīng)符合設(shè)備管理要求（標識清晰正確，在合格計量校驗期內(nèi)定期維護保養(yǎng)等）；與細胞接觸的器械應(yīng)經(jīng)消毒滅菌并在有效期內(nèi)。細胞制備、檢測所用物料應(yīng)經(jīng)確認來自合格供應(yīng)商，關(guān)鍵物料均應(yīng)經(jīng)抽樣檢測并確認其質(zhì)量合格。試劑及耗材的有效期應(yīng)在規(guī)定期限內(nèi)，批號應(yīng)按照要求記錄下來以便具有可追溯性。應(yīng)核對供者檢測報告，其內(nèi)容至少包括：乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗體（HCVAb）、梅毒螺旋體特異性抗體（Anti-TP）、人類免疫缺陷病毒I/Ⅱ型抗體（HIV-I/ⅡAb）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）等，其余檢測項目全部符合質(zhì)量標準要求。采集時間距制備時間在要求時限以內(nèi)，無凝血現(xiàn)象，病原體檢測及篩查標準按照產(chǎn)品質(zhì)量標準執(zhí)行。細胞分離、處理、檢測和過程監(jiān)控程序應(yīng)與