分子生物學(xué)-第五章作業(yè)

分子生物學(xué)第五章作業(yè)1，哪些重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)和實驗推動了 DNA重組技術(shù)的產(chǎn)生及發(fā)展？答：重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達(dá)。年份事件1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由"質(zhì)粒"DNA所決定。1966M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。1978首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986GMO首次在環(huán)境中釋放。1988J.D.Watson出任"人類基因組計劃"首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小氧--"Oncomouse"。1992歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb)1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2，如何理解PCR擴(kuò)增儀的原理及過程？答：聚合酶連反應(yīng)技術(shù)又稱PCR技術(shù)（1）PCR的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。首先將雙鏈DNA在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，然后以單鏈DNA為模板，并利用反應(yīng)物中的四種脫氧核苷酸合成新的DNA互補鏈。（2）PCR的基本過程加入模板DNA，PCR引物，四種核苷酸，即適當(dāng)濃度Mg，DNA聚合酶，經(jīng)過;1.變性（Denaturation）：將待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性成兩條單鏈；2.退火（Annealing）：降低溫度，使單鏈靶序列與寡核苷酸引物退火；3.延伸（Extension）：在適當(dāng)條件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，產(chǎn)生新的雙鏈。上述變性、退火、延伸步驟的重復(fù)循環(huán)，導(dǎo)致特異的靶序列的指數(shù)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物是介于引物的5’端之間的雙鏈DNA片段。3，簡述定量PCR的原理和過程？答：（1）利用熒光測量的PCR儀對整個PCR過程中擴(kuò)曾DNA的積累速力繪制動態(tài)變化圖，從而消除了在測定終端產(chǎn)物豐度時有較大變異系數(shù)問題。（2）反應(yīng)在帶透明蓋的塑料管中進(jìn)行，激發(fā)光可以直接透過管蓋，使其中的激發(fā)光被激發(fā)，熒光探針事先混合在PCR反應(yīng)液中，只有與DNA結(jié)合后，才能被激發(fā)發(fā)出熒光，隨著新合成目的DNA片段的增加，結(jié)合到DNA上得熒光探針，即被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)增加。最簡單的DNA結(jié)合的熒光探針是非序列特異性的，一般探針不能區(qū)分不同的雙鏈DNA，所以人們設(shè)計了能與目的DNA特異性結(jié)合的熒光探針，如TapMan探針（是一小段被設(shè)計成可以與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA并且該單鏈DNA的3，端和5，端帶有短波長和長波長兩個不同熒光集團(tuán)這兩個熒光集團(tuán)由于距離靠近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用下會發(fā)生熒光粗滅因而檢測不到熒光，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行TapMan探針結(jié)合到目的DNA序列上并挨餓會被具有外切酶活性的TapMan聚合酶逐個切除而降解被切下來的集團(tuán)解除了熒光粗滅的束縛會在激發(fā)光下發(fā)出熒光因此產(chǎn)生的熒光直接反映了擴(kuò)增靶DNA的總量）4，基因組DNA文庫和cDNA文庫在構(gòu)建原理和用途上的主要區(qū)別是什么?答構(gòu)建原理上得區(qū)別：Ⅰ真核基因組文庫基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體，構(gòu)建基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體常用的構(gòu)建真核生物細(xì)胞基因組文庫的載體是λ噬菌體和粘性質(zhì)粒。構(gòu)建基因組文庫的步驟1、載體的制備2、基因組DNA的制備3、載體與基因組DNA的連接4、體外包裝提取物的制備和重組DNA的體外包裝5、重組噬菌體滴度的檢測、擴(kuò)增與保存基因組文庫ⅡcDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫：真核生物mRNA逆轉(zhuǎn)錄所形成的DNA稱為cDNA。將cDNA與載體DNA重組，并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌里或包裝成噬菌體顆粒，得到一系列克隆群體。這樣的克隆群體叫做cDNA文庫。cDNA文庫可直接進(jìn)行篩選目的基因，由于cDNA中不含內(nèi)含子，因此所篩選的基因可以直接表達(dá)。構(gòu)建cDNA文庫主要包括以下幾個步驟：1、mRNA的分離2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA與載體的連接：5、噬菌體的包裝、轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化如果用質(zhì)粒DNA做載體，cDNA與載體連接后可直接轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，建立cDNA文庫。如采用噬菌體為載體，必需經(jīng)過體外包裝，形成噬菌體顆粒，感染宿主菌。RNA提取將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA。用途上的區(qū)別：DNA基因庫廣泛用于細(xì)菌，真菌等基因組較小的物種的研究，及基因組作圖，測序和克隆序列的對比。cDNA基因庫可用于篩選基因，大規(guī)模測序，基因芯片雜交等功能基因組學(xué)研究5，基因克隆的方法主要有哪幾種？簡述各種方法的原理和用途？基因克隆(genecloning)：又稱為重組DNA技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過程。基因克隆的方法：EAVE技術(shù)，應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因，Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)，基因的圖位克隆法。基本步驟：(1)用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化；(2)外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)；(3)將人工重組的DNA分子導(dǎo)入它們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞；(4)重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選。6，在基因操作實驗中有哪些檢測核酸和蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的方法？檢測蛋白質(zhì)核酸相對分子質(zhì)量的基因操作方法有：定時定量PCR技術(shù)，核酸凝膠電泳技術(shù)7.蛋白質(zhì)組學(xué)得研究對象和目的是什么？需要有哪些技術(shù)和方法？蛋白質(zhì)組學(xué)致力于研究某一物種，個體，器官，組織或細(xì)胞在特定條件，特定時間所表達(dá)以得到全部蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。需要的技術(shù)有：蛋白質(zhì)分離技術(shù)（雙向電泳技術(shù)，蛋白質(zhì)印記法，蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)）及鑒定技術(shù)（現(xiàn)代質(zhì)譜）8，SNP作為三代遺傳標(biāo)記的優(yōu)點是什么？普遍簡