第六章 工業(yè)微生物產生菌的分離篩選課件

第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選本章內容：含微生物樣品的采集含微生物樣品的富集培養(yǎng)微生物的分離野生菌株的篩選和目的產物的鑒別第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選菌種改進發(fā)酵工藝和設備得到理想的發(fā)酵產品從自然界中分離得到，經過篩選、純化及培養(yǎng)條件的研究第一株應用于發(fā)酵工業(yè)的青霉素生產菌是從美國伊利諾斯洲長霉的葡萄柚中分離出來第一株頭孢霉素生產菌則來自于意大利撒丁島的污水中。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選菌種收集和篩選途徑

向菌種保藏機構索取有的菌株，從中篩選所需菌株。

由自然界采集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。

從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產生菌，從酒醪中分離淀粉酶或糖化酶的產生菌等。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選第一節(jié)含微生物樣品的采集一、從土壤中采樣（一）根據土壤特點1.土壤有機質含量和通氣狀況5—25cm土層，適合微生物生長，每克土中含菌數約幾十萬到幾十億個。酵母菌分布土層最淺，約5—10cm，霉菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選2.土壤酸堿度和植被狀況偏堿土壤環(huán)境，適合于細菌、放線菌生長。偏酸的土壤環(huán)境下，霉菌、酵母菌生長旺盛。植物根部的分泌物有所不同，即植被對微生物分布也有一定的影響。如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C產生菌。葡萄或其他果樹在果實成熟時，其根部附近土壤中酵母菌數量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌數量比其他植被下占優(yōu)勢。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選3.地理條件南方土壤比北方土壤中的微生物數量和種類都要多，特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)的土壤。許多工業(yè)微生物菌種，如抗生素產生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多從南方土壤中篩選出來。——南方溫度高，溫暖季節(jié)長，雨水多，相對濕度高，植物種類多，植被覆蓋面大，土壤有機質豐富，造成得天獨厚的微生物生長環(huán)境。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選4.季節(jié)條件不同季節(jié)微生物數量有明顯的變化，冬季溫度低，氣候干燥，微生物生長緩慢，數量最少。到了春天隨著氣溫的升高，微生物生長旺盛，數量逐漸增加。南方，春季往往雨水多，土壤含水量高，通氣不良，即使有微生物所需的溫度、濕度，也不利于其生長繁殖。隨后經過夏季到秋季，約有7—10個月處在較高的溫度和豐富的植被下，土壤中微生物數量比任何時候都多，因此，秋季采土樣最為理想。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選（二）采樣方法用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5—25cm處的土樣10—25g，裝入事先準備好的塑料袋內扎好。北方土壤干燥，可在10—30cm處取樣。給塑料袋編號并記錄地點、土壤質地、植被名稱、時間及其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應馬上分離，以免微生物死亡。如果樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠，難以做到及時分離，則可事先用選擇性培養(yǎng)基做好試管斜面，隨身帶走。將取好的土樣混勻，取3—4g撒到試管斜面上，可避免菌株不能及時分離而死亡。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選二、根據微生物生理特點采樣1.根據微生物營養(yǎng)類型每種微生物對碳、氮源的需求不一樣，分布也有差異。微生物的營養(yǎng)需求和代謝類型與其生長環(huán)境有著很大的相關性。如：森林土富含纖維素——適合纖維素酶產生菌的生長；肉類加工廠附近和飯店排水溝的污水、污泥中——分離蛋白酶和脂肪酶產生菌；面粉加工廠、糕點廠、酒廠及淀粉加工廠等場所——分離產生淀粉酶、糖化酶的菌株。蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中——篩選酵母菌。柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠——分離果膠酶產生菌。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選2.根據微生物的生理特性在篩選一些具有特殊性質的微生物時，需根據該微生物獨特的生理特性到相應的地點采樣。如：篩選高溫酶產生菌時，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火上爆發(fā)處及北方的堆肥中采樣；海洋底部采樣——分離耐壓菌；甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣——分離耐高滲透壓酵母菌。

若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產或處理這種化合物的工廠附近采集樣品，容易得到滿意的結果。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選2.極端環(huán)境條件的影響高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽或高輻射強度的環(huán)境下，也有少數微生物存在，這類微生物被稱為極端微生物。生活所處的特殊環(huán)境，導致它們具有不同于一般微生物的遺傳特性、特殊結構和生理機能，因而在冶金、采礦及生產特殊酶制劑方面有著巨大的應用價值。1.局部環(huán)境條件的影響微生物的分布除了本身的生理特性和環(huán)境條件綜合因素的影響之外，還要受局部環(huán)境條件的影響。海洋對于微生物來說是一個特殊的局部環(huán)境，使海洋微生物具備特殊的生理活性，相應也產生了一些不同于陸地來源的特殊產物。具有特殊性質的微生物通常分布在一些特殊的環(huán)境中。三、特殊環(huán)境下采樣第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選第二節(jié)含微生物樣品的富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時，根據微生物的生理特點，設計一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利分離到所需要的菌株。富集培養(yǎng)主要根據微生物的碳、氮源、pH、溫度、需氧等生理因素加以控制。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選一、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分

微生物的代謝類型十分豐富，其分布狀態(tài)隨環(huán)境條件的不同而異。在富集培養(yǎng)時，還需根據微生物的不同種類選用相應的富集培養(yǎng)基。根據微生物對環(huán)境因子的耐受范圍具有可塑性的特點，可通過連續(xù)富集培養(yǎng)的方法分離降解高濃度污染物的環(huán)保菌。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選二、控制培養(yǎng)條件

在篩選某些微生物時，除通過培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇外，還可通過它們對pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達到有效的分離目的。如細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏堿，霉菌和酵母菌要求偏酸。分離放線菌時，可將樣品液在40℃恒溫預處理20min，有利于孢子的萌發(fā)，可以較大地增加放線菌數目，達到富集的目的。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選三、抑制不需要的菌類

在分離篩選的過程中，除了通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，增加富集微生物的數量以利于分離外，還可通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達到富集的目的。如土壤中分離芽孢桿菌，可先將土樣加熱到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h篩選霉菌時，可在培養(yǎng)集中加入四環(huán)素等抗生素抑制細菌分離放線菌時，在樣品懸浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素、鏈霉素，以及丙酸鈉抑制霉菌和細菌的生長。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選第三節(jié)微生物的分離一、好氣微生物的分離（一）稀釋涂布法（二）劃線分離法（三）利用平皿的生化反應進行分離1.透明圈法在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會在菌落周圍產生透明圈，圈的大小初步反應該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產生菌時采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產生菌的分離。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選2.變色圈法對于一些不易產生透明圈產物的產生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如：篩選果膠酶產生菌時，用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現絳紅色水解圈。分離谷氨酸產生菌時，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.2—7.6，當pH在6.2以下時為黃色，pH7.6以上為藍色。通過平板上產生的變色圈還可快速分離篩選產乙醇的菌株。在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上，覆蓋一層含有鹽類物質的瓊脂，該藍色物質在乙醇脫氫酶和NAD作用下（在少量乙醇存在時）反應產生的電子脫色。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選3.生長圈法生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產生菌。工具菌是一些相對應的營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈。4.抑菌圈法常用于抗生素產生菌的分離篩選。抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選（四）組織分離法1.對一般有病組織的分離方法——是由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的方法。如從患惡苗病的水稻組織中分離赤霉菌，從根瘤中分離根瘤菌，及從各種食用的子實體中分離孢子等。切除小塊含菌組織——洗去表面污物——10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2—5min，無菌水沖洗——移至平皿上培養(yǎng)——觀察菌落——挑入斜面培養(yǎng)——分離純化、篩選。從豆科植物的根瘤中分離根瘤菌：取根瘤——10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2—5min，無菌水沖洗——用無菌鑷子將根瘤壓破，取汁液少許與分離培養(yǎng)基混合倒入平皿，攤平，培養(yǎng)——觀察菌落——挑入斜面培養(yǎng)。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選2.食用菌孢子分離法（1）多孢子分離法（2）單孢子分離法（五）單細胞或單孢子分離法（六）特殊菌類——環(huán)保降解菌的分離第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選二、通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離1.培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分2.培養(yǎng)基的pH3.排除不需要的菌類4.控制培養(yǎng)溫度第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選三、厭氣菌的分離（一）加還原劑分離培養(yǎng)基內加入還原劑，如半胱氨酸、D型維生素C、硫化鈉等，操作時以最快的速度劃線分離，然后立即置于事先已抽真空密閉的容器內（充CO2或N2也可），于適溫培養(yǎng)。（二）焦性沒食子酸法焦性沒食子酸和NaOH互相反應除去氧氣。要除去100mL空氣中的氧氣需要焦性沒食子酸固體1g和10%NaOH溶液10mL。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選（六）生物吸氧法（五）玻璃板隔絕空氣培養(yǎng)法（四）試管厭氣培養(yǎng)法（三）平皿厭氣培養(yǎng)法第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選第四節(jié)野生菌株的篩選和目的產物的鑒別一、初篩1.平板篩選

初篩是從大量分離到的微生物中將具有合成目的產物的微生物篩選出來的過程。由于菌株多，工作量大，為了提高初篩的效率，通常需要設計一種快速、簡便又較為準確的篩選方法。

對那些在純化分離階段沒有采用平皿定性法挑選出來的菌落，即隨機挑選的菌株，由于數量很大，又不知是否具有目的產物的生產能力，這時只能首先采取較粗放的檢測方法：第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選

對那些在純化分離階段沒有采用平皿定性法挑選出來的菌落，即隨機挑選的菌株，由于數量很大，又不知是否具有目的產物的生產能力，這時只能首先采取較粗放的檢測方法：

如篩選產生堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌時，可以將分離得到的菌株，點種在含有0.3%—0.4%酪蛋白的瓊脂平板上，適溫培養(yǎng)后，測量形成的水解圈直徑和菌落直徑的比值來表示酶活力的強弱。挑選其中產酶能力強的菌株進一步用搖瓶培養(yǎng)、篩選。

第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選

在篩選谷氨酸菌種時，用一種不含有機氮（如蛋白胨）的培養(yǎng)基，使分離得到的菌株在這種培養(yǎng)基上形成單菌落，用內徑6—8mm的打孔器，把菌落連同瓊脂培養(yǎng)基逐個取出，放在滅過菌的濾紙上，放置一定時間，菌落產生的氨基酸會滲透并擴散到濾紙上，噴上茚三酮，出現成色圈者即為氨基酸的產生菌。菌種選育工作者在初篩時經常使用這種平皿快速檢測法，將復雜而費時的化學測定改為平皿上肉眼可見的顯色或生化反應，能較大幅度地提高篩選效率，減少工作量。如以往在分離生物表面活性劑產生菌時，傳統(tǒng)方法：測定菌株的排油活性、表面張力、乳化性能等，工作量大，效率低。改良法：根據生物表面活性劑能夠溶血的原理，把加入羊血的培養(yǎng)基作成平板，將菌株逐個點種，適溫培養(yǎng)1—2d，挑選溶血的單菌落。第六章工業(yè)微生物產生菌的分離篩選2.搖瓶發(fā)酵篩選

由于搖瓶振蕩培養(yǎng)法更接近于發(fā)酵罐培養(yǎng)的條件，效果比較一致，由此篩選到的菌株易于推廣。

一個菌株接一個瓶，在一定轉速的搖瓶機上及適宜的溫度下振蕩培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液過濾后進行活性測定：取玻璃板16cm×26cm或18cm×28cm，制備含有鑒定菌（測定抗生素）或底物（酶制劑）等的平板。瓊脂板厚約3mm，用內徑5mm鋼圈打孔，取以上過濾后的發(fā)酵液10l逐個加入，放在鑒定菌或酶作用最適溫度下溫育一定時間，孔的周圍出現透明的溶菌圈或水解圈。根據活性圈的大小決定取舍。第六章工業(yè)微