分子生物學(xué)考試資料

第一題：1) Replicon復(fù)制子是DNA復(fù)制是從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)開始，最終由這個(gè)起點(diǎn)起始的復(fù)制叉完成的片段。DNA中發(fā)生復(fù)制的獨(dú)立單位稱為復(fù)制子。2) leadingstrand前導(dǎo)鏈：與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致，通過連續(xù)的5′-3′聚合合成的新的DNA鏈。3) transposableelement轉(zhuǎn)座因子：又叫可移動(dòng)因子，它是指一段特定的DNA序列，可從原來的位置上單獨(dú)復(fù)制或自動(dòng)脫落下來，經(jīng)環(huán)化后再插入到染色體其他位置，并對(duì)插入位置的附近基因產(chǎn)生各種遺傳學(xué)效應(yīng)。4) proteome蛋白質(zhì)組：蛋白質(zhì)組是指組織或細(xì)胞中所有的蛋白質(zhì)的集合。5) interruptedgene間隔基因或斷裂基因（splittinggene）即真核生物的結(jié)構(gòu)基因是由若干個(gè)外顯子和內(nèi)含子序列相間隔排列組成的間隔基因。6) trans-acting反式作用：DNA通過其產(chǎn)物(mRNA或蛋白質(zhì))間接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。Transcription轉(zhuǎn)錄，epigenetics表觀遺傳學(xué)，transcriptome轉(zhuǎn)錄組，metabolome代謝組,allele等位基因，cistron順反子，muton突變子，recon重組子，lactoseoperon乳糖操縱子，insertionsequence(IS)插入序列，RNApolymeraseRNA聚合酶,retro-transposon反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，genome基因組，semiconservativereplication半保留復(fù)制,semi-discontinuousreplication半不保留復(fù)制,translation翻譯,laggingstrand后隨鏈,replisome復(fù)制體,telomerase端粒酶,sensestrand正義鏈,isoacceptingtRNA同工tRNA,antisensestrand反義鏈,promoter啟動(dòng)子,terminator終止子,intron內(nèi)含子，exon外顯子.1) genome基因組：基因組應(yīng)該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。2) proteome蛋白質(zhì)組，同上3) interruptedgene間斷基因：真核生物結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)被非編碼區(qū)所間隔（同上）4) intron內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。5) exon外顯子：在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列6) transposon轉(zhuǎn)座子：直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的反式作用因子transcription轉(zhuǎn)錄,epigenetics表觀遺傳學(xué)，transcriptome轉(zhuǎn)錄組，metabolome代謝組,cistron順反子，mutant突變子，recon重組子，lactoseoperon乳糖操縱子，insertionsequence(IS)插入序列，pseudogene假基因，RNApolymeraseRNA聚合酶,cis-acting反式作用，replicon復(fù)制子，semiconservativereplication半保留復(fù)制,semi-discontinuousreplication半不保留復(fù)制,leadingstrand先導(dǎo)鏈,laggingstrand后隨鏈,replisome復(fù)制體,telomerase端粒酶,CvalueC值,sensestrand正義鏈,antisensestrand反義鏈,promoter啟動(dòng)子,terminator終止子,transcriptionalunit轉(zhuǎn)錄單元第二題，談?wù)勗诖竽c桿菌中如何高效表達(dá)一個(gè)真核生物的基因？一個(gè)好的大腸桿菌系統(tǒng)應(yīng)該滿足：1.盡可能低的誘導(dǎo)表達(dá)；具有快速簡(jiǎn)便的誘導(dǎo)方式；能夠高表達(dá)多種基因；易于進(jìn)行克隆操作；能直接進(jìn)行點(diǎn)突變和DNA序列分析而不要壓克隆。表達(dá)載體應(yīng)該能夠獨(dú)立復(fù)制，具有多個(gè)復(fù)制位點(diǎn)，便于進(jìn)行篩選，具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子和終止子。同時(shí)必須將真核基因編碼區(qū)連接在大腸桿菌RNA聚合酶能夠識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下。有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，所產(chǎn)生的mRNA必須有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列。

將真核基因克隆到一個(gè)強(qiáng)大的原核啟動(dòng)子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核體系中；采用真核基因的cDNA序列作為構(gòu)建表達(dá)載體的目的基因，這樣就解決了原核生物沒有RNA剪接功能的問題；構(gòu)建載體時(shí)，將真核基因插在幾個(gè)原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識(shí)別和降解，最后可以將多肽切除。第三題：簡(jiǎn)述原核生物RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)以及每個(gè)亞基的功能。答：原核生物RNA聚合酶由五個(gè)亞基組成的分子量五聚體蛋白質(zhì)。五個(gè)亞基分別為兩條α鏈，一條β鏈、一條β'鏈和一條σ因子鏈。其中前四個(gè)亞基組成核心酶，核心酶加上σ因子稱為全酶。α鏈：決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性β鏈：與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān)β'鏈：結(jié)合DNA模板σ因子：辨認(rèn)起始位點(diǎn)第四題，結(jié)合你的課題談?wù)勀銓碚n題研究中會(huì)用到哪些分子生物學(xué)技術(shù)手段，并談?wù)劽糠N技術(shù)方法的原理（至少談4種方法）答：在將來的研究中我可能會(huì)用到以下技術(shù)（大家自己選四種就好了）：PCR技術(shù)，根據(jù)DNA分子在高溫時(shí)會(huì)發(fā)生變性，兩條雙鏈分開；溫度下降后會(huì)發(fā)生退火，兩條雙鏈重新結(jié)合這個(gè)原理。首先將雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種dNTP合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。因?yàn)镈NA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動(dòng)（“引導(dǎo)”）新鏈的合成，所以，新生DNA鏈的起點(diǎn)由寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點(diǎn)所決定。整個(gè)PCR反應(yīng)的全過程，即DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA相結(jié)合（退火）、DNA合成（鏈的延伸）三步，可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Westernblotting），原理：用電泳的方法來分離蛋白質(zhì)，是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下,向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用。SDS是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。步驟：1、蛋白提?。?、等蛋白濃度的配制；3、SDS過程；4、轉(zhuǎn)膜；5、封閉與雜交；6、發(fā)光顯色克隆基因分離技術(shù)中：應(yīng)用核酸探針克隆目的基因。原理：把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進(jìn)行菌落或噬菌斑雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆，這個(gè)過程叫作克隆基因的分離或篩選核酸凝膠電泳技術(shù)：自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。因?yàn)楹怂釒ж?fù)電性，所以把所加的樣品加到電源負(fù)極，使其順著正極移動(dòng)。限制性核酸內(nèi)切酶技術(shù)：是可以識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。因其能夠定位在外源DNA片段上，并在特定的DNA位點(diǎn)進(jìn)行剪切。所以可以用來剪切我們所需要的目的基因片段。細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，細(xì)菌轉(zhuǎn)化是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。第五題，談?wù)勅绾慰寺∫还δ芤阎蛄形粗脑松锘蛘哒婧松锏幕?答：選擇含有目的基因的組織或細(xì)胞，分離其mRNA，以分離的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,然后利用cDNA第一鏈末端（3’端）的發(fā)夾結(jié)構(gòu)為引物合成第二鏈cDNA并與第一鏈形成雙鏈cDNA,隨后將合成的cDNA重組到質(zhì)粒或噬菌體載體上，構(gòu)建cDNA文庫，對(duì)于λ噬菌體構(gòu)建的cDNA文庫，把體外包裝的噬菌體顆粒感染瓊脂平板上的菌苔；若用構(gòu)建的cDNA文庫則把轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布在瓊脂平板上，對(duì)于得到的每個(gè)噬菌斑或菌落中都含有一個(gè)被克隆的cDNA片段，再用硝酸纖維素膜或尼龍膜進(jìn)行拷貝或復(fù)制，即把每個(gè)噬菌斑或菌落中的一部分核酸精確的從主平板印染到濾膜上。然后再進(jìn)行篩選，完成該基因的克隆。其中在篩選目的cDNA時(shí)由于該基因功能已知，所以應(yīng)該用功能結(jié)合法篩選。功能結(jié)合法篩選又分為噬菌體顯示法，酵母雙雜交法和酵母單雜交法。其中酵母雙雜交法的原理如下：將編碼某一蛋白X（誘餌bait）的DNA序列與DNA結(jié)合域（BD）的編碼序列連接使其表達(dá)融合蛋白（BD-X），然后將待檢基因（Y）的cDNA與DNA激活域（AD）的編碼序列連接，使其表達(dá)融合蛋白（AD-Y），將兩個(gè)融合基因所在載體共同轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（含報(bào)告基因上游激活序列USA）。若X與Y不能相互作用，則不表達(dá)報(bào)告基因，若X與Y相互作用，則使BD與AD靠近形成有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，因此，可通過報(bào)告基因的表達(dá)與否，篩選可與誘導(dǎo)餌X結(jié)合的目的基因Y。當(dāng)然cDNA法克隆僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因。第六題，一個(gè)真核生物的基因在大腸桿菌中不能得到高效表達(dá)，可能的原因有哪些？答：表達(dá)載體不夠優(yōu)化，稀有密碼子表達(dá)不夠高，真核生物外源基因的mRNA不夠穩(wěn)定，大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達(dá)產(chǎn)物的誘導(dǎo)下，蛋白水解酶的活性可能會(huì)增加，將表達(dá)產(chǎn)物降解，發(fā)酵條件不夠優(yōu)化，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的總量取決于外源基因表達(dá)水平和菌體濃度。在保持單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質(zhì)合成的總量。第七題，原核生物RNA聚合酶是如何找到啟動(dòng)子的？真核生物RNA聚合酶與之相比有何異同？

答：大腸桿菌RNA聚合酶在σ亞基引導(dǎo)下識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上。單獨(dú)的核心酶也能與DNA結(jié)合，σ因子的存在對(duì)核心酶的構(gòu)象有較大影響，極大降低了RNA聚合酶與DNA一般序列的結(jié)合常數(shù)和停留時(shí)間。RNA聚合酶可通過擴(kuò)散與DNA任意部位結(jié)合，這種結(jié)合是松散的，并且是可逆的。全酶不斷變化與DNA結(jié)合部位，直到遇上啟動(dòng)子序列，隨即有疏松結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槔喂探Y(jié)合，并且DNA雙鏈被局部解開。真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物，它們的RNA聚合酶也更為復(fù)雜。真核生物RNA聚合酶主要有三類：RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄45SrRNA前體，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生5.8SrRNA，18SrRNA和28SrRNA。RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所有的mRNA前體和大多數(shù)SnRNA。RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄所tRNA，5SrRNA等小分子轉(zhuǎn)錄物。真核生物RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程大體于細(xì)菌相似，所不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子上，而需要在啟動(dòng)子上有轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶裝配成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物才能起始轉(zhuǎn)錄。第八題，如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)克隆原核生物的復(fù)制起點(diǎn)？答：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(diǎn),常用ori或o表示。細(xì)胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開始就會(huì)連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細(xì)胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開始直到終點(diǎn)為止，每個(gè)這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細(xì)胞中，每個(gè)DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，因而只有一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制起點(diǎn)DNA區(qū)段的克隆方法：根據(jù)該原核生物的基因序列確定限制性內(nèi)切酶，再利用這種限制性內(nèi)切酶分別酶E.coliDNA和具有抗生素抗性基因的質(zhì)粒DNA（例如Ampr），選擇最小的E.coliDNA片段與DNA片段連接后，轉(zhuǎn)化缺乏Ampr基因的受菌體(Amps)，接種于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，根據(jù)只有同時(shí)具有具有oriC和Ampr的重組DNA的菌落才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能正常繁殖的原則，選擇能正常生長(zhǎng)的單菌落，搖床過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定驗(yàn)證克隆到E.coli復(fù)制起點(diǎn)區(qū)的DNA片段，通過測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證克隆結(jié)果。第九題，一個(gè)基因如何產(chǎn)生多種不同類型的mRNA分子？

答：一個(gè)基因產(chǎn)生一種以上mRNA的方式主要有兩種。第一種是：一個(gè)原初轉(zhuǎn)錄物含有一個(gè)以上的多腺苷化位點(diǎn)，就能產(chǎn)生一種以上的具有不同3ˊ末端的mRNA。第二種是：如果一個(gè)原初轉(zhuǎn)錄物含有幾個(gè)外顯子，那么，會(huì)發(fā)生不同的剪接，就會(huì)產(chǎn)生多種mRNA。此外，RNA編輯可以通過某些核苷酸的修飾，插入或缺失，產(chǎn)生不同類型的mRNA。

第十題，談?wù)勅绾慰寺∫还δ芤阎蛄形粗恼婧松锏幕虼穑?、由功能推知基因編碼的氨基酸序列，進(jìn)而得出密碼子序列，最后得到基因的脫氧核苷酸序列，然后進(jìn)行人工合成，用PCR技術(shù)增殖即可。2、Phagedisplay的基本操作過程為:(1)提取某一病原體基因組DNA,用超聲波將DNA切割成500～1500的片段;(2)將片段末端用T4DNA聚合酶處理后,與載體DNA(p