基因工程講義2

5基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)（1）核酸內(nèi)切限制酶（restrictionendonucleases）1）寄主控制的限制(restriction)與修飾現(xiàn)象(modification)2）核酸內(nèi)切限制酶的類型(I型、II型、III型）

3）核酸內(nèi)切限制酶的基本特性同裂酶（isoschizomers）

同尾酶（isocaudamer）4）核酸內(nèi)切限制酶的命名法大腸桿菌（Escherichiacoli）縮寫為Eco

流感噬血菌（Haemophilusinfluenzae）縮寫為Hin5）影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素

a.DNA的純度，b.DNA的甲基化程度，c.反應(yīng)溫度，

d.DNA的分子結(jié)構(gòu)，e.核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液6）核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用

a.結(jié)合模式，b.局部消化，c.消化作用

核酸內(nèi)切限制酶EcoRI及修飾的甲基化酶MEcoRI的限制與修飾作用核酸內(nèi)切限制酶HindIII對(duì)雙鏈DNA分子的切割作用具有粘性末端的DNA片段結(jié)合方式堿性磷酸酶的脫磷酸作用阻止線性的質(zhì)粒DNA分子再環(huán)化（2）DNA連接酶（Ligase）1）粘性末端DNA片段的連接2）平末端DNA片段的連接

a.同聚物加尾法（homopolymertail-joining）b.銜接物連接法（linker）c.DNA接頭連接法（adapter）3）熱穩(wěn)定的DNA連接酶（thermostableDNAligase）a.寡核苷酸連接測(cè)定法（oligonucleotideligationassay）b.連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ligasechainreaction，LCR）或連接擴(kuò)增反應(yīng)（ligationamplificationreaction）a）裂口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

LCR探針（LCRprobe）b）不對(duì)稱裂口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（AG—LCR）

應(yīng)用互補(bǔ)的同聚物加尾法連接DNA片段用銜接物分子連接平末端的DNA片段雙銜接物連接法的基本程序具異常的5’-OH粘性末端結(jié)構(gòu)的BamHI接頭的連接機(jī)理寡核苷酸連接測(cè)定原理DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）原理不對(duì)稱裂口DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（AG-LCR）的分子機(jī)里（3）DNA聚合酶（DNApolymerase）

1）DNA聚合酶Ia.DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）b.DNA雜交探針的制備2）大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段與DNA末端標(biāo)記3）T4DNA聚合酶取代合成法標(biāo)記DNA片段4）依賴RNA的DNA聚合酶與互補(bǔ)DNA的合成5）T7DNA聚合酶6）修飾的T7DNA聚合酶DNA聚合酶I催化合成DNA合成鏈按5’—3’方向延長(zhǎng)線性和環(huán)形DNA分子的取代缺口轉(zhuǎn)移用T4DNA聚合酶的取代合成法標(biāo)記DNA片段末端制備探針（4）DNA和RNA的修飾酶1）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾（terminaldeoxynucleotidyltransferase）2）T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）與DNA分子5’末端的標(biāo)記3）堿性磷酸酶與DNA脫磷酸作用細(xì)菌堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase）

小牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase）（5）核酸外切酶（exonucleases）1）核酸外切酶VII（exoVII）2）核酸外切酶III（exoIII）3）入核酸外切酶（入exo）和T7基因6核酸外切酶

堿性磷酸酶的活性（6）單鏈核酸內(nèi)切酶（singleendonucleases）1）SI核酸酶與RNA分子定位

2）Bal31核酸酶與限制位點(diǎn)的確定

SI核酸酶的活性

同摸板DNA有共同線性關(guān)系的RNA分子的定位

Bal31核酸酶的活性