血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用課件

血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用主要內(nèi)容紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子基礎(chǔ)ABO血型系統(tǒng)Rh血型系統(tǒng)H血型系統(tǒng)(類孟買型)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用小結(jié)血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用有關(guān)分子生物學(xué)概念點(diǎn)突變同義突變無(wú)義突變有義突變起始密碼突變?nèi)笔Р迦胫嘏叛头肿釉\斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用有關(guān)分子生物學(xué)概念基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常點(diǎn)突變插入缺失易位和重排拷貝數(shù)擴(kuò)增DNA多態(tài)性基因的檢測(cè)血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用常見(jiàn)突變示意圖ATGCGGTAGCGTAGTCTGATGCGATAGCGTAGTCTGATACGGTAGCGTAGTCTGATGCGGGTAGCGTAGTCTGATGCGTAGCGTAGTCTG血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用新等位基因形成血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用紅細(xì)胞血型系統(tǒng)40個(gè)基因1250個(gè)等位基因(截止2012年5月12日)參見(jiàn)BloodGroupAntigenGeneMutationDatabase血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用紅細(xì)胞血型分子機(jī)制點(diǎn)突變同義突變、無(wú)義突變、有義突變、起始密碼突變、拼接接受位點(diǎn)插入缺失基因重組（RHD/RHCE）基因部分重復(fù)血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO血型分子生物學(xué)研究1990年Yamamoto等首次克隆基因定位于染色體9q34ABO基因cDNA，其分子量為41,000Dalton，DNA長(zhǎng)度為1062bpABO血型系統(tǒng)為三復(fù)等位基因，有A、B、O三個(gè)基因ABO基因包括7個(gè)外顯子，長(zhǎng)度大于18kb大多數(shù)編碼序列位于第6和7外顯子血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO基因示意圖血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用常見(jiàn)等位基因A和B基因編碼的蛋白都是353個(gè)氨基酸，O基因編碼的蛋白只有115個(gè)氨基酸A101、A102、B101、O01、O02A101作為參考序列A102等位基因C467T(Pro-Leu)B101基因在297、526、657、703、796、803、930、1096位有8個(gè)核苷酸與A101基因不同但只有526、703、796、803四個(gè)核苷酸的變化造成了氨基酸序列的變化（A101依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨酸，B101依次是甘氨酸、絲氨酸、蛋氨酸和丙氨酸）O01基因在261位的G缺失,提前終止血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO亞型頻率分布ABO血型中存在ABO亞型臨床輸血和獻(xiàn)血者檢測(cè)中常見(jiàn)440617份A亞型22份AxB11例，AelB3例，Ax3例，Ael2例，Amh2例，A31例B亞型41份Bx11例，B39例，ABx7例，AB35例，Bel3例，Bm2例，ABel1例，ABend1例，ABm1例，Bend1例。B(A)1例CisAB2例A214例A2B35例引自中國(guó)輸血雜志2006，19（1）：25血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO亞型的分子研究通過(guò)檢測(cè)261、526、703、796、803位的核苷酸可以確認(rèn)大多數(shù)典型的ABO血型的基因型近年來(lái)對(duì)血清學(xué)分類的ABO血型亞型抗原，應(yīng)用PCR、DNA測(cè)序等技術(shù)，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上進(jìn)行研究結(jié)果表明：原為同一亞型的抗原存在異質(zhì)性，即血清學(xué)上同一亞型，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上有可能存在差異。幾個(gè)位點(diǎn)以外的核苷酸變化引起的ABO血型亞型常會(huì)引起檢測(cè)結(jié)果的偏差發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)為290個(gè)（2012年05月22日）血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用A等位基因可簡(jiǎn)要分為7大類等位基因A1、A2、A3、Ax、Ael、Aw、AmA101等位基因序列作為參照標(biāo)準(zhǔn)A102(C467T)（在中國(guó)人群中比例大于A101)A103(C467T,C564T)A104(A297G)A105(A297G,B-O1重組)A106(B-O02重組)A205(A1009G)血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用B等位基因型可簡(jiǎn)要分為5大類等位基因B1、B3、Bx、Bel、BwB等位基因中297、703、796、803位基本恒定B101-B118B101:A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G803C;G930A;G1096AB301-B308B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096A,C1054T血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用O等位基因O01－O74

大多數(shù)261nt缺失，13個(gè)261nt不缺失O01:261delGO02:261delG、T646A、G681T、C771T、G829A人群中常見(jiàn)003:261G、A297G,C526G,G802AO50血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用CisAB和B(A)等位基因CisAB01-06CisAB01:C467T,G803CCisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C,B(A)01-06B(A)型單克隆試劑應(yīng)用于臨床后，抗A試劑偶爾與原定為B型的紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，這類含有大量B抗原極少A抗原的紅細(xì)胞稱之為B(A)型B(A)01:A297G,C526G,796A,G803C,G930A,G1096AB(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096A血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的ABO等位基因A208allele*C467T;G539CA210allele*268T>C;467C>T

A211allele*266C>T;467C>T

B112

allele*297A>G;526C>G;559C>T;657C>T;703G>A;796C>A;803G>C;930G>A

B305

allele*297A>G;425T>C;526C>G;657C>T;703G>A;796C>A;803G>C;930G>AB307

allele*297A>G;410C>T;526C>G;657C>T;703G>A;796C>A;803G>C;930G>ABw12allele*C278TCisAB05allele*A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G930A

O61allele*261del743C血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO基因診斷PCR-SSPPCR-RFLPPCR-SSOPCR-SSCPPCR-SBT261G干擾正反定型不一致血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO亞型分子機(jī)制和診斷凝集強(qiáng)度改變正反定型不一致點(diǎn)突變?yōu)橹鱌CR-SSP261GPCR-SBTSNP(單核苷酸多態(tài)性)血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO亞型分子機(jī)制和診斷PCR-SBT常見(jiàn)為6-7外顯子擴(kuò)增雙向測(cè)序存在風(fēng)險(xiǎn)：擴(kuò)增引物SNP多態(tài)性位點(diǎn)在其它位置其它機(jī)制：表觀遺傳、其它血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO亞型分子機(jī)制和診斷PCR-SBT1-7外顯子擴(kuò)增技術(shù)和策略全長(zhǎng)18kb一般3對(duì)引物以上外顯子上的突變ATG位置突變其它機(jī)制？？血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用ABO亞型分子機(jī)制和診斷基層實(shí)驗(yàn)室如何有效獲取信息血清學(xué)結(jié)果家系分析保存抗凝全血-20℃以下尋求分子診斷實(shí)驗(yàn)室?guī)椭头肿釉\斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用Rh血型基因基因位于1號(hào)染色體短臂上，即1P34—36兩個(gè)基因：RHD編碼D抗原，RHCE編碼CcEe抗原RHD和RHCE基因同源性高達(dá)96%以上RHD和RHCE基因均有10個(gè)外顯子血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用RHD基因第1、2、8、10外顯子的編碼序列與RHCE的相對(duì)應(yīng)序列相同RHD基因第3、4、5、6和第9外顯子序列與RHCE基因有區(qū)別兩個(gè)RH基因緊密連鎖，相隔30000bp兩個(gè)基因的3‘末端面對(duì)面兩個(gè)基因之間有一個(gè)獨(dú)立的基因SMP1RHD和RHCE兩個(gè)基因之間以及外側(cè)分別有1個(gè)Rhesus盒SMP1基因距中間一個(gè)Rhesus盒下游僅15bp血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用RHCE和RHD基因組成示意圖1p34-p36血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用Rh血型等位基因RHAGRHDRHCE突變和缺失、基因轉(zhuǎn)換、基因重組RHD218RHCE104RHAG23血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用RHD等位基因RhD陽(yáng)性正常RhD陽(yáng)性弱D(weakD)部分D(partialD)DelRhD陰性RHD基因缺失RHD基因功能喪失血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用部分弱D的分子突變點(diǎn)RHDweakDtype1T809GRHDweakDtype1.1C5G;T809GRHDweakDtype2G1154ARHDweakDtype3C8GRHDweakDintron5'5Aintron35‘G5ARHDweakDtype33(Taiwan1)G520ARHDweakDtypeTaiwan2T809ARHDweakDtype51A594T;C602GRHDweakDtype5292T>CRHDweakDtype53T740G分子機(jī)制堿基突變?nèi)笔RNA拼接位點(diǎn)變異血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用部分D分子機(jī)制PartialD發(fā)現(xiàn)等位基因70多個(gè)

-RHDVa2T667G;G697C;G712A;G1273CRHDVa3G697ARHDVa4hybridD(1-4)CE5D(6-10)RHDVItypeIhybrid(D1-3)CE(4,5)D(6-10)RHDVItypeIIhybridD(1-3)CE(4-6)D(7-10)RHDVItypeIIIhybridD(1,2)CE(3-6)D(7-10)RHDVItypeIVhybridD1Ce(2/3-5)D(6-10)分子機(jī)制基因交換RHD-CE-D點(diǎn)突變血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用部分D分子機(jī)制示意圖血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用Del分子機(jī)制Del（Delution）亞洲人群常見(jiàn)RHDDEL(Cde)1intron3G1ARHDDEL(Cde)2G885TRHDDEL(Cde)3intron9G1A;G1227ARHDDEL(Cde)4intron538delCTCTRHDDEL(Cde)51252insTRHDDEL(Cde)6T1203ARHDDel(Cde)7G3ARHDDel(Cde)8C28TRHDDel(Cde)9T53CRHDDel(Cde)10T251CRHDDELT1222CRHDDelintron8-9:del1013RHDDELexon8del995ntincluding3'intron7+exon8+5'intron8血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用RhD陰性的機(jī)制不同Rh陰性表現(xiàn)型頻率不同RHD陰性的可能機(jī)制RHD基因缺失RHD基因發(fā)生改變RHD-CE-D融合基因RHD基因的第3到9外顯子被RHCE基因取代RHD陰性個(gè)體中約1/3具有完整的RHD基因非洲D(zhuǎn)陰性個(gè)體具有RHDψ（假基因）血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用RHCE等位基因RHCE等位基因104個(gè)正常RHCERHce48C

RHCEG48CRHCE(1)D(2-10)

RHCE(1)D(2-10)RHCED-ChineseRH(D1-9CE10)

RH(CE1D2-7CE8-10)hybridCE(1)D(2-7)CE(8-10)RHCE685-687del685-687delAGARHCEnullamorph2Intron4:G1T血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用9例弱D樣本RHD845A5例（RHDweakDtype15）RHD1227A3例（D-el(CDe);minimalexpressionofDantigen;

）RHD1013C1例（RHDweakDtype24）10例部分D樣本Dva(Kou)1例Dva(Hus)1例DVa-like(YH)1例DVItypeIII7例MolecularbasisofDvariantsinChinesepersons.Transfusion.2007;47(3):471-7

本實(shí)驗(yàn)室部分檢測(cè)結(jié)果Rh表型樣本量RHD+/RHD+

RHD+/RHD-

RHD-/RHD-

RhD陽(yáng)性198186（93.94%）12（6.06%）0（0）WeakD323（9.37%）29（93.63%）0（0）RhD陰性20810（4.81%）53（25.48%）145（69.71%）血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用RHD血型分子診斷RhD陰性多重PCR技術(shù)FQ-PCRPCR-RFLPDVariantPCR-SSP測(cè)序技術(shù)血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用RHD血型分子診斷分子機(jī)制復(fù)雜RhD陰性分子機(jī)制基因交換RHD-CE-D疑難標(biāo)本單一技術(shù)難以判定多種技術(shù)并存血清學(xué)結(jié)果血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用H血型系統(tǒng)H抗原與ABO血型，Lewis血型密切相關(guān)，屬于Hh血型系統(tǒng)（ISBT018）血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用其它血型系統(tǒng)血清學(xué)特性分子機(jī)制點(diǎn)突變基因重組PCR-SSP基因芯片血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用其它血型系統(tǒng)罕見(jiàn)表型血清學(xué)特性基因定位測(cè)序技術(shù)體外表達(dá)血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷技術(shù)的應(yīng)用紅細(xì)胞血型的診斷人群遺傳的分析譜細(xì)胞血型的診斷罕見(jiàn)表型分子機(jī)制研究疑難血型的判斷多次輸血后的血型檢測(cè)產(chǎn)前血型的診斷血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷技術(shù)的應(yīng)用罕見(jiàn)表型多次輸血病人ABO、RhD血型的不一致RhD變異體弱表達(dá)的基因情況RHD雜合度篩選稀有系統(tǒng)（抗體缺乏）譜細(xì)胞血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用紅細(xì)胞血型中采用的技術(shù)PCR-RFLPPCR-SSP多重PCR技術(shù)PCR-SBTPCR-SSCPPCR-RQ基因芯片方法的優(yōu)缺點(diǎn)與血清學(xué)方法的比較血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用紅細(xì)胞血型系統(tǒng)基因分型技術(shù)PCR-RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)通過(guò)PCR擴(kuò)增出包含突變位點(diǎn)的特定片段利用限制性內(nèi)切酶消化片段經(jīng)凝膠電泳不同的片斷大小檢測(cè)便能確認(rèn)基因型方法特性操作較簡(jiǎn)單酶切過(guò)程需要控制血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用PCR-RFLP復(fù)合PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)ABO基因型.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,1999年第2期復(fù)合PCR技術(shù)在ABO血型基因分型中的應(yīng)用,北京醫(yī)學(xué)2007年第29卷第2期血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用PCR-SSP利用3‘堿基特性分別設(shè)計(jì)一系列序列特異性引物直接擴(kuò)增出目的基因片段通過(guò)凝膠電泳觀察方法特性簡(jiǎn)單快捷易于操作基于已知序列血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用PCR-SSCP選擇性擴(kuò)增基因片段加熱或用變性劑解開(kāi)DNA雙鏈由于等位基因的核苷酸順序的不同，二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異在聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳遷移率不同分析電泳帶型即可區(qū)別開(kāi)等位基因血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用DNA測(cè)序法通過(guò)PCR擴(kuò)增基因的主要片段，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行序列分析測(cè)定，分析發(fā)生突變的堿基便可確認(rèn)血型血型及其亞型的分子基礎(chǔ)本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠需要特殊的儀器設(shè)備操作煩瑣，成本高血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)雙脫氧終止法化學(xué)降解法高通量測(cè)序血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用Partialsequenceinexon6O01alleleBw12alleleAnovelallele血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用基因芯片技術(shù)2005年Transfusion45(5):654-9Transfusion45(5):667-679高通量同時(shí)分析多個(gè)系統(tǒng)多個(gè)位點(diǎn)(等位基因）快速可靠可自動(dòng)化國(guó)外產(chǎn)品為主血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用