血液檢驗(yàn)基本技術(shù)-血涂片制備與染色（臨床檢驗(yàn)課件）

血涂片的制備推片將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動(dòng)。圖1-3血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀）

血涂片制備推片載玻片血液將推片勻速向前，勿停頓。涂片的厚薄取決于速度和角度：快、大(厚)。慢、?。ū。┮粡垵M意的血涂片應(yīng)厚薄均勻頭體尾鮮明涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫上姓名和編號(hào)李四B123血涂片制備實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)試劑操作步驟注意事項(xiàng)目

錄CONTENTS實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆昭科苽涞牟僮鞑襟E實(shí)驗(yàn)原理使用推片將血液在載玻片上制成血膜試驗(yàn)器材一次性采血針、酒精棉球、鑷子、脫脂洗凈的載玻片、推片試驗(yàn)器材操作步驟器具選擇1

質(zhì)量控制3

血涂片的制備過程（常用手工推片法）2

器具選擇01載玻片要求國(guó)內(nèi)1.0mm×26mm×（76±0.5）mm，制備血涂片所用的載玻片必須是潔凈、干燥、中性的、無油膩。

02推玻片要求推片兩端邊緣整齊、平滑。也可選用大小、厚度與玻片相同、兩端邊緣光滑的有機(jī)玻璃。03標(biāo)本要求可用抗凝血和非抗凝血。最好用非抗凝血，但隨著血細(xì)胞分析儀的普及，血標(biāo)本多為EDTA抗凝血，可引起紅細(xì)胞皺縮及白細(xì)胞叢集，故推制血涂片應(yīng)盡早進(jìn)行（最遲在1～2h內(nèi)進(jìn)行）血涂片的制備過程（常用手工推片法）

01取血皮膚采血法采集血標(biāo)本，取一滴綠豆大小的血標(biāo)本在載玻片的一端，離端點(diǎn)約1.5cm處。

02推片左手拿載玻片，右手拿推玻片放在血滴前并接觸血滴，使血滴沿推片散開成一線。03干燥將制備好的血膜，立即在空中揮動(dòng)，使其迅速干燥，以避免血細(xì)胞皺縮變形。04標(biāo)記涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫上姓名和編號(hào)質(zhì)量控制一張良好的血涂片要求血膜外觀厚薄適宜，頭、體、尾分明，細(xì)胞分布均勻，邊緣整齊，兩側(cè)留有空隙。血涂片制備推片載玻片血液將推片勻速向前，勿停頓。涂片的厚薄取決于速度和角度：快、大(厚)。慢、?。ū。┮粡垵M意的血涂片應(yīng)厚薄均勻頭體尾鮮明涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫上姓名和編號(hào)李四B123注意事項(xiàng)（一）玻片1載玻片應(yīng)潔凈、干燥、中性、無油膩。推片2推片時(shí)速度要一致，否則血膜成波浪形，厚薄不勻，初學(xué)者可把玻片放在桌上操作。注意事項(xiàng)（二）推片后3推好的血涂片應(yīng)立即在空氣中揮動(dòng)使其盡快干燥，天氣寒冷或潮濕時(shí)，應(yīng)將涂片置于37℃恒溫箱中保溫促干，以免細(xì)胞變性縮小。時(shí)間要求4血涂片應(yīng)在1h之內(nèi)染色或在1h之內(nèi)用無水甲醇（含水量<3%)固定后染色。血涂片染色目錄染色1

觀察2

染色瑞氏染色法01姬姆薩染色法02瑞氏-吉姆薩染色03染色方法01瑞氏染色法PartOne1堿性染料為陽(yáng)離子染料，能接受質(zhì)子，細(xì)胞核的染料。如亞甲藍(lán)、天青。能結(jié)合酸性物質(zhì)并染色，如淋巴細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞染成藍(lán)色2酸性染料為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。如伊紅。能結(jié)合細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分等染成紅色。染料組成毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等物理作用a.染料的化學(xué)成分：助色基團(tuán)的存在，堿性染料在溶媒中為陽(yáng)離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。b.蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時(shí)還有其它活性基團(tuán)。在游離狀態(tài)時(shí)，-NH2獲得一個(gè)H+變成帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個(gè)H+變成帶負(fù)電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。c.周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pH＜pI，則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之，pH＞pI，則結(jié)合堿性染料。化學(xué)作用原理

圖1-4瑞氏染色原理示意圖

嗜堿性粒細(xì)胞試劑01瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0mlWright染液02

有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)。增加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對(duì)染料的吸附作用，增強(qiáng)染色效果。甲醇：03

（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g,蒸餾水加到1000ml。磷酸鹽緩沖液用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。A加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。B滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。C用清水沖洗，待干后鏡檢。。D染色方法質(zhì)量控制血膜要干透后才能染色，否則染色時(shí)易脫落.染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時(shí)間長(zhǎng)些效果好。染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時(shí)間也不能長(zhǎng)。染色過淡，可復(fù)染。染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色.中性桿狀核粒細(xì)胞

嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞02姬姆薩染色法PartTwo原

理

吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。但本法對(duì)細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長(zhǎng)，可用復(fù)合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液，按瑞特染色法染10min?；蛳扔萌鹛厝旧ㄈ旧?，再用稀釋吉姆薩復(fù)染。吉姆薩染料1.0g甘油66.0ml甲醇（AR）66.0ml[染色方法]1.甲醇固定干燥血膜3-5min2.將血膜在染液中浸染10-30min3.流水沖洗,待干后鏡檢試劑03瑞氏-吉姆薩染色PartThree試

劑瑞特染料1.0g吉姆薩染料0.3g甲醇（AR)加至500ml先將瑞特染料和吉姆薩染料充分研磨混勻，甲醇溶解倒入容器中，未溶解完的繼續(xù)加入甲醇研磨，重復(fù)多次，最后把染液加至500ml。染色方法

血片加滴加染液5滴，并立即將染液蓋滿血膜，2min后加入pH6.4-6.8磷酸鹽緩沖液（同瑞氏染液）10滴，10min后用流水沖洗干凈，待干后鏡檢。

方法學(xué)評(píng)價(jià)

瑞氏染液和吉姆薩染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)有各自的顯色特征，前者對(duì)細(xì)胞質(zhì)和顆粒著色較好，后者對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。因此將二者結(jié)合，能取長(zhǎng)補(bǔ)短、集中優(yōu)勢(shì)，用該混合染液對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對(duì)比鮮明。瑞氏-吉姆薩混合染色法是臨床上廣泛使用的方法。04巴氏染色法PartFour是脫落細(xì)胞染色法中較好的染色方法。觀察1.染色情況(滿意、偏酸、偏堿）2.細(xì)胞分布情況油鏡下分類計(jì)數(shù)：體尾交界處。油鏡分類時(shí)應(yīng)按一定走向，不要重復(fù)計(jì)數(shù)。李四123低倍鏡觀察適宜不適宜不適宜血涂片染色實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)試劑操作步驟注意事項(xiàng)目

錄CONTENTS實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆昭科鹗先旧脑砗筒僮鞑襟E，熟悉瑞氏染液的組成和配制實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞的染色既有物理吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種血細(xì)胞及細(xì)胞的不同成分對(duì)酸性染料和堿性染料的親和力不同，因而經(jīng)瑞氏染液染色后各種血細(xì)胞呈現(xiàn)各自的染色特征。試驗(yàn)器材、試劑載玻片、吸耳球、染色架、顯微鏡實(shí)驗(yàn)器材試劑Wright’s染液pH6.8磷酸鹽緩沖液操作步驟（一）01制片血涂片制備

02標(biāo)記待血涂片干透后，用蠟筆在血膜的兩端劃線并編號(hào)。03染色加瑞氏染液3~5滴，覆蓋整個(gè)血膜，固定細(xì)胞約0.5～1min。滴加等量或稍多的緩沖液，用洗耳球?qū)?zhǔn)涂片吹氣，使染液充分混勻。操作步驟（二）05鏡檢血膜外觀呈紫紅色。顯微鏡下，紅細(xì)胞呈粉紅色，細(xì)胞核呈紫紅色，嗜酸性顆粒呈橘紅色，嗜堿