腫瘤個(gè)體化治療基因檢測(cè)教程課件

腫瘤個(gè)體化治療基因檢測(cè)教程教程目錄第一章病理常規(guī)操作第二章樣本前處理（申請(qǐng)單填寫、標(biāo)本類型、標(biāo)本評(píng)估及登記等）第三章樣本預(yù)處理（DNA、RNA提取及質(zhì)量評(píng)估）第四章基因操作（測(cè)序、片段分析及Q-PCR）第五章結(jié)果解讀及診斷報(bào)告出具第六章資料匯總，資料庫(kù)建立第一章病理常規(guī)操作1.病理樣本的接收2.組織固定3.取材4.包埋5.組織石蠟切片6.HE染色首先核對(duì)病理申請(qǐng)單與標(biāo)本上的紅色號(hào)碼是否一致。核查病理申請(qǐng)單上寫明的送檢標(biāo)本及數(shù)目是否與實(shí)際送檢標(biāo)本一致。觀察送檢標(biāo)本的大小及固定液比例是否合適。(1)穿刺活檢及纖支鏡所取的小標(biāo)本，4％中性甲醛(10％中性福爾馬林)固定組織的量應(yīng)在6～10倍。(2)對(duì)于較大的手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)及時(shí)切開(kāi)固定；核對(duì)后將病理申請(qǐng)單和標(biāo)本編上病理標(biāo)本號(hào)。12345作為病理資料不僅要做好計(jì)算機(jī)錄入工作，還須進(jìn)行文字登記，以便病理檔案長(zhǎng)期保存。將病人姓名、性別、年齡、病歷號(hào)、科別、臨床診斷、部位、標(biāo)本來(lái)源、標(biāo)本例數(shù)等逐項(xiàng)錄入電腦存儲(chǔ)。臨床醫(yī)師切取標(biāo)本后，應(yīng)盡快將標(biāo)本置于盛有足夠量固定液的容器內(nèi)，盡量避免可能出現(xiàn)固定不及時(shí)或不充分導(dǎo)致標(biāo)本干涸或腐敗，無(wú)法進(jìn)行切片制作。添加的量應(yīng)6～10倍于標(biāo)本體積.3.取材及其后期處理病理科病理醫(yī)生取材核對(duì)標(biāo)本及其標(biāo)志與申請(qǐng)單是否一致。按照病理取材規(guī)范選取病變及正常組織。對(duì)送檢標(biāo)本進(jìn)行大體描述。取材后的標(biāo)本保存至少兩周。放入自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行水洗－脫水－透明－浸蠟前處理。包埋先將熔化的石蠟傾入模具，再用加熱的鑷子夾取已經(jīng)浸蠟的組織塊，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蠟。注意標(biāo)本的編號(hào)和標(biāo)本要對(duì)準(zhǔn)，防止污染。為下一步切片準(zhǔn)備，提供介質(zhì)。125.切片撈片，烘干。03切5-10um的連續(xù)組織切片，置于玻片上。02刀片鋒利，組織塊預(yù)冷。016.HE染色蘇木素－伊紅染色。蘇木素染細(xì)胞核（核酸），伊紅染細(xì)胞質(zhì)（蛋白），使組織細(xì)胞對(duì)比清晰，便于顯微鏡下觀察。主要流程：二甲苯脫蠟－梯度酒精脫二甲苯－蘇木素染色－分化、返藍(lán)－伊紅－梯度酒精、二甲苯－封片?！杜R床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊(cè)》2004年第1版第二章標(biāo)本前處理申請(qǐng)單填寫登記患者基本情況，包括姓名、性別、年齡、送檢單位、床位、門診號(hào)/住院號(hào)、送檢日期、取材部位、病理診斷、標(biāo)本病理號(hào)等患者簽署知情同意書(shū)，留下聯(lián)系方式患者病史及臨床情況患者病史及臨床情況登記事項(xiàng)壹有無(wú)手術(shù)（穿刺標(biāo)本）肆相關(guān)病史及家族史叁癌癥有無(wú)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)或者不能切除貳手術(shù)時(shí)間術(shù)前術(shù)后有無(wú)化療，化療方案及化療效果及毒副作用（相關(guān)血項(xiàng)指標(biāo)、胃腸反應(yīng)、皮膚反應(yīng)、神經(jīng)反應(yīng)等），治療的單位。新鮮標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定或用RNAlater浸泡20分鐘以上（常溫可保存10天）外借病理蠟塊，常規(guī)病理大小即可常規(guī)石蠟切片（10張白片），5-10um，常溫送檢外周全血；胸腹水；痰；尿新鮮(冰凍)標(biāo)本；內(nèi)鏡活檢標(biāo)本；手術(shù)標(biāo)本蠟塊或切片樣本評(píng)估蠟塊或白片：組織保存時(shí)間、福爾馬林固定時(shí)間、組織大小、有無(wú)癌細(xì)胞胸腹水、尿及痰：涂片HE染色觀察結(jié)果是否有癌細(xì)胞血：保存溫度、時(shí)間，是否凝固將申請(qǐng)單登記入冊(cè)01登記基因檢測(cè)申請(qǐng)?zhí)?、姓名、送檢單位、病理號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目02檢測(cè)項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測(cè)內(nèi)容樣本類型EGFR突變外顯子18,19,21,(CA)n非小細(xì)胞肺癌、食道癌、頭頸腫瘤等預(yù)測(cè)吉非替尼（易瑞沙）、厄羅替尼（特羅凱）石蠟白片或胸水300mL外顯子20(T790M)K-ras突變密碼子12,13,61腸癌、肺癌、胃癌、甲狀腺癌預(yù)測(cè)西妥昔單抗（愛(ài)比妥）、帕尼單抗（維克替比）療效，甲狀腺癌輔助診斷石蠟白片BRAF突變V600EC-kit突變外顯子9,11,17胃腸間質(zhì)瘤、肉瘤預(yù)測(cè)伊馬替尼（格列衛(wèi)）療效石蠟白片PDGFα突變外顯子14、18檢測(cè)項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測(cè)內(nèi)容樣本類型JAK-2突變外顯子12，14真性紅細(xì)胞增多癥，原發(fā)性骨髓纖維化、原發(fā)性血小板增多癥輔助臨床診斷2mL抗凝血或骨髓活檢預(yù)測(cè)化療和α干擾素療效ABL突變酪氨酸激酶區(qū)點(diǎn)突變髓細(xì)胞白血病預(yù)測(cè)伊馬替尼（格列衛(wèi)）療效2mL抗凝血或骨髓活檢Her-2/CEP17FISH乳腺癌、胃癌乳頭狀癌診斷石蠟白片預(yù)測(cè)曲妥珠單抗（赫賽?。┋熜EGF/β-actinVEGFR/β-actinmRNA表達(dá)量腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、腎癌預(yù)測(cè)貝伐單抗（阿瓦斯丁）療效石蠟白片+2mL抗凝血檢測(cè)項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測(cè)內(nèi)容樣本類型ERCC1/β-actinmRNA表達(dá)量肺癌、胃癌、腸癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌、膽囊癌預(yù)測(cè)鉑類療效石蠟白片+2mL抗凝血預(yù)測(cè)鉑類療效BRCA1/β-actinmRNA表達(dá)量紫杉醇類和長(zhǎng)春堿類藥物療效RRM1/β-actinmRNA表達(dá)量肺癌、胰腺癌、膽管癌預(yù)測(cè)吉西他濱療效石蠟白片+2mL抗凝血TS/β-actinmRNA表達(dá)量胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、預(yù)測(cè)氟尿嘧啶類藥物療效石蠟白片+2mL抗凝血肺癌預(yù)測(cè)培美曲塞療效檢測(cè)項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測(cè)內(nèi)容樣本類型TOP-ⅡA/CEP17FISH/mRNA表達(dá)量乳腺癌預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物療效石蠟白片+2mL抗凝血預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物毒性UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌預(yù)測(cè)伊立替康毒性石蠟白片前處理烤片（90-95℃，0.5小時(shí)）脫蠟（過(guò)夜，最后一缸換新二甲苯）HE染色鏡下區(qū)分選擇腫瘤組織刮片消化腫瘤組織（200μlTL+20μlOB酶，55℃2-3h消化時(shí)間視具體情況定）DNA的提取血DNA的提取01石蠟組織DNA的提取02250μl抗凝血加入250μlBufferBL和25μlOB酶，70℃孵育15分鐘。加入260μl無(wú)水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉(zhuǎn)入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。將收集柱置一新收集管上，加入500μlHBsolution，12000rpm離心2分鐘。加入700μlwashBuffer，12000rpm離心2分鐘?？账﹄x心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50μl70℃預(yù)熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測(cè)提取DNA質(zhì)量（或用分光光度計(jì)定量并記錄）。OmegaBloodDNAkitprotocol在消化充分的組織中加入220μlBUfferBL，震蕩混合，于70℃孵育。加入220μl無(wú)水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉(zhuǎn)入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。將收集柱置一新收集管上，加入500μlHBsolution，12000rpm離心2分鐘。加入700μlwashBuffer，12000rpm離心2分鐘?？账﹄x心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50μl70℃預(yù)熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測(cè)提取DNA質(zhì)量（或用分光光度計(jì)定量并記錄）。OmegaTissuseDNAkitprotocolRNA的提取石蠟組織RNA的提取血RNA的提取（化療后需1200微升血→白細(xì)胞太少）RNAlater樣本處理另注加入250μlbufferPKD和10μl的蛋白酶K,渦旋混勻后，55°C孵育2-3h，80°C15min。然后加入500μl的bufferRBC，充分混勻。將溶液轉(zhuǎn)入gDNAEliminatorspin柱內(nèi)，10000g離心30s，吸取收集管內(nèi)液體至新的離心管，重復(fù)操作直至溶液都過(guò)濾收集柱。在溶液內(nèi)加入1200μl無(wú)水乙醇，混勻，將溶液轉(zhuǎn)入RNeasyMinElutespin柱內(nèi)，10000g離心15s，棄收集管內(nèi)液體。加入500μlbufferRPE，10000g離心15min，棄收集管內(nèi)液體。加入500μlbufferRPE,10000g離心2min。小心將柱取出，放入一新的收集管內(nèi)，最大速度離心5min（將柱蓋打開(kāi)）將柱放入1.5ml收集管內(nèi)，加入40-60μl無(wú)Rnase酶水，蓋上蓋子，室溫放置2min，最大速度離心1min洗脫RNA.QiagenRNEASYFFPERNAkitprotocol300μl全血+1500μl1×bufferERL（150μl10×ERL+1350μlH2O）混勻。同時(shí)做3管。冰上孵育10min，至半透明。450g4℃，10min，棄上清。600μl1×bufferERL混勻，洗滌細(xì)胞。洗滌后合并3管液體。450g4℃，10min，棄上清。600μlTRK裂解液+12μlβ-巰基乙醇吹打混勻（可以暫時(shí)-70℃凍存）。加等體積70%乙醇，吹打混勻。將液體轉(zhuǎn)入HiBindRNA提取柱內(nèi)（<800μl/次），10000g離心1min，棄收集管內(nèi)液體，重復(fù)操作直至所有液體都過(guò)柱。加700μlRNAwashBufferⅠ，10000g離心1min棄收集管內(nèi)液體。換新的收集管，加500μlRNAwashBufferⅡ，10000g離心1min棄收集管內(nèi)液體。柱內(nèi)加500μlRNAwashBufferⅡ，10000g離心1min棄收集管內(nèi)液體。12000g空柱離心2min。取一新的1.5ml離心管，在柱中央加入40μl洗脫液，12000g離心1min。核酸蛋白儀檢測(cè)提取RNA純度及濃度。-70℃保存RNA。OmegaBloodRNAkitprotocol>2.1:核酸降解<1.6:蛋白質(zhì)污染OD260/OD2801.8~2.0:純度好Quantifiler數(shù)據(jù)評(píng)估提取RNA質(zhì)量DNA提取測(cè)序反應(yīng)上機(jī)測(cè)序及結(jié)果分析PCR擴(kuò)增電泳檢驗(yàn)電泳檢驗(yàn)，PCR產(chǎn)物純化測(cè)序產(chǎn)物純化反應(yīng)體系為：10×bufferdNTP(2mM)Mg2+TaqGenomeDNAPrimer-F（10μM）Primer-R（10μM）H2O2μl2μl0.75μl0.25μl1μl0.4μl0.4μl13.2μlTotal20μlPCR反應(yīng)條件：01置PCR擴(kuò)增儀中95℃預(yù)變性15min，用TouchdownPCR，94℃變性50秒，63℃-58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共循環(huán)10次，94℃變性50秒，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共循環(huán)30次，最后于72℃延伸10分鐘。02用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶。PCR產(chǎn)物純化0504020301加100μlPCR-A液，混勻，轉(zhuǎn)入純化柱內(nèi)，室溫靜置10min，12000rpm離心2min。棄收集管內(nèi)液體，加700μlwashingbuffer，12000rpm離心2min。棄收集管內(nèi)液體，加400μlwashingbuffer，12000rpm離心2min。棄收集管內(nèi)液體，12000rpm離心2min。柱內(nèi)加30μl70°C預(yù)熱洗脫液，12000rpm離心2min。反應(yīng)體系為：BigDye（2.5X）0.8μl

BigDyeSeqBuffer（5X）1.6μl

Primer0.3μlPCR純化產(chǎn)物1μlddH2O6.3μlTotal10μl測(cè)序產(chǎn)物純化1每管加1μlEDTA（125mM）;1μlNaAc（3M）到管里。2每管加100μl100%酒精，震蕩混勻，室溫靜置15min。310°C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min。4每管加100μl70%酒精，5°C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min。537°C;30min揮發(fā)凈酒精，加10μlHi-Di溶解DNA。695°C；變性5min，4°C；4min，加樣上機(jī)。避光加LIZ、HIDI混合變性PCR擴(kuò)增上機(jī)測(cè)序及結(jié)果分析步驟1多重?zé)晒釶CR：15μlPCRmix＋五種（胃腸）或七種（尿）引物0.8μl（其中D17S283加1.2μl）＋1μlDNA.條件：95°C15min，94°C1min，56°C1min，72°C1min，30個(gè)cycle.２μlPCR產(chǎn)物＋0.4μlLIZsizestandard+8μlHiDi,95°C5min,4°C冰冷5min。上機(jī)，分析數(shù)據(jù)。123RNA提取Q-PCR儀擴(kuò)增結(jié)果分析RT分光光度計(jì)評(píng)估質(zhì)量1.RT反應(yīng):gDNA1μl+RNA6μl；上機(jī)42°C，2min；離心。RTBuffer2μl，RT酶0.5μl，Primer0.5μl；上機(jī)A64程序。2.Q-PCR儀擴(kuò)增（反應(yīng)體系）2×SYBR2.5μlPrimer1(5uM)0.5μlPrimer2(5uM)0.5μlRT產(chǎn)物1μlNuclease-freewater1μlTotal

5μl7900PCR儀反應(yīng)程序95°C10min；95°C15s；60°C1min