DB41T 1588-2018 飼料中沙門氏菌的檢測 EMA-PCR法

DB41DB41/T1588—2018飼料中沙門氏菌的檢測EMA-PCR法2018-04-17發(fā)布2018-07-17實施河南省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I1）：4.42×PremixTaq緩沖液：內含TaqDNA聚合酶1.25a）上游引物：5＇-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG-3';4.11疊氮溴化乙錠（EMA，0.2mg/mL見附錄A的A.5。4.12溴化乙錠（10mg/mL）。4.13滅菌離心管：1.5mL，15mL。25.4離心機：轉速≥12000r/min。取25g試樣于225mL緩沖蛋白胨水（4.2）中，充分混勻，36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h進行預增菌，取0.1mL預增菌液轉移至10mL氯化鎂-孔雀綠增菌液（4.3）中，42℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。如果試樣量不取1mL增菌液至離心管中，12000r/min離心2min，棄上清。加入1mL滅菌水懸浮沉淀物，離心管開蓋置于冰上，鹵素燈照射下曝光2min，然后水浴煮沸10min，再將離心管轉移至冰浴中使其稱取1.5g瓊脂糖（4.6）加入100mL1×TAE電泳緩沖左右，加入5μL溴化乙錠（4.12），充分混勻，根據需要在模板內放入合適的梳子，倒入凝膠3與1μL6×上樣緩沖液（4.10）混合后加入到上樣孔內，設Mar恒壓下電泳20min～30min。如果沙門氏菌陽性對照的PCR產物在284bp處出現(xiàn)條帶（參見附錄B），同時陰性對照PCR產物于284bp處未出現(xiàn)條帶，則檢測結果成立；樣品的PCR產物電泳后在284bp處出現(xiàn)條帶，則為疑似陽性樣品，此時需按GB/T13091進行確證，樣品的PCR產物電泳后在284bp處未出現(xiàn)條帶，判定25g樣品中未檢出沙門氏菌。4培養(yǎng)基和試劑A.1.1成分10.0g5.0g9.0g水1000mLA.1.2制法A.2.1.1成分蛋白胨5.0g氯化鈉8.0g磷酸二氫鉀1.6g水1000mLA.2.1.2制法A.2.2.1成分2O）400g水1000mLA.2.2.2制法A.2.3.1成分5孔雀綠0.4gA.2.3.2制法A.2.4完全培養(yǎng)基A.2.4.1成分溶液A1000mL溶液B100mLA.2.4.2制法按上述比例配制，調節(jié)至pH5.2，分裝每管10mL。115℃高壓滅菌15min。A.3.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.3.2制法調節(jié)至pH8.3，定容至1L后，室溫保存。使用時稀釋50倍即為A.4.1成分0.5g0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06mL360mL640mLA.4.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL滅菌水中，加入溴酚藍和二甲苯氰FF溶解，與甘油混合，定容至1000mL，分裝后4℃保存。6A.5.1成分疊氮溴化乙錠5mg滅菌水25mL