生物學(xué)案：專題課題土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1．研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用。2．進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定.一、研究思路1．篩選菌株尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)____肥,但不能直接被農(nóng)作物吸收利用，只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成____之后，才能被植物利用。土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣蒧_____。（1）實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理：人為提供有利于目的______生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、______、pH等)，同時(shí)______或______其他微生物生長(zhǎng).（2）選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中,將允許________的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)______或______其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。2．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目(1）常用來統(tǒng)計(jì)樣品中______數(shù)目的方法是________.即當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的________.通過統(tǒng)計(jì)平板上的________，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在________的平板進(jìn)行計(jì)數(shù).統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目____.這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落.因此,統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用________來表示。（2）____________也是測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法。(3）細(xì)菌的數(shù)目還可以通過______法來測(cè)定。例如，測(cè)定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目，可將________的水過濾后，將濾膜放到________培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)____色，可以根據(jù)培養(yǎng)基上________的數(shù)目，計(jì)算出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。3．設(shè)置對(duì)照(1）設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中__________對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的________。（2）對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了________的條件以外，其他條件都______的實(shí)驗(yàn),其作用是比照實(shí)驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果.二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括對(duì)實(shí)驗(yàn)方案，所需儀器、材料,用具和藥品，具體的________以及時(shí)間安排等的綜合考慮和安排。關(guān)于土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：1．土壤取樣土壤中的微生物70％～90％是_____，絕大多數(shù)分布在距地表______的近____性土壤中。2．樣品的稀釋樣品的________將直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目。通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在________之間、適于計(jì)數(shù)的平板.測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用____________倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng).第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，可將稀釋范圍放寬一點(diǎn)，以保證能從中選擇出適于計(jì)數(shù)的平板.3．微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物,往往需要不同的培養(yǎng)______和培養(yǎng)______。細(xì)菌一般在30~37℃的溫度下培養(yǎng)1~2d，放線菌一般在25～28℃的溫度下培養(yǎng)5～7d，而霉菌一般在25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取____________時(shí)的記錄作為結(jié)果,以防止因____________而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目.一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。菌落的特征包括______________和______等方面。思考：土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱,為什么？三、操作提示1．無菌操作2．做好標(biāo)記3．制定計(jì)劃四、對(duì)分離得到的分解尿素的細(xì)菌的鑒定1．在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中,細(xì)菌合成的______將尿素分解成了____.氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性______，pH______。因此，可以通過檢測(cè)培養(yǎng)基____的變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。2．在以______為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入______指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變____,說明該種細(xì)菌能夠________。答案：一、1。氮氨脲酶(1)菌株溫度抑制阻止（2）特定種類抑制阻止2．（1）活菌稀釋涂布平板法一個(gè)活菌菌落數(shù)30～300低菌落數(shù)（2）顯微鏡直接計(jì)數(shù)（3）濾膜已知體積伊紅美藍(lán)黑黑色菌落3．（1）非測(cè)試因素可信度（2)被測(cè)試相同二、實(shí)施步驟1．細(xì)菌3～8cm2．稀釋程度30～300104、105、1063．溫度時(shí)間菌落數(shù)目穩(wěn)定培養(yǎng)時(shí)間不足形狀、大小、隆起程度顏色思考：由于土壤具備了各種微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件，是微生物生活的良好環(huán)境.四、1.脲酶氨增強(qiáng)升高pH2．尿素酚紅紅分解尿素1．培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類型配制特點(diǎn)主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多菌種分離，計(jì)數(shù)半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，培養(yǎng)基成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥劑菌種的鑒別選擇培養(yǎng)基添加（或缺少）某種化學(xué)成分菌種的分離選擇培養(yǎng)基配制時(shí)可添加某種化學(xué)成分,這里的“添加”是在基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入的。配制固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基時(shí)加入的瓊脂是從紅藻中提取的,其主要成分是水溶性多糖,在配制培養(yǎng)基中作為凝固劑。2．選擇培養(yǎng)基一般來說，選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)成分，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。如,加入青霉素可以抑制細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)，分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，但不影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，從而分離得到該菌.培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分的缺少也可達(dá)到分離微生物的目的.如培養(yǎng)基中缺乏氮源時(shí),可以分離固氮微生物,因?yàn)榉枪痰⑸锊荒茉诖伺囵B(yǎng)基上生存.當(dāng)培養(yǎng)基的某種營(yíng)養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時(shí)，也具有分離效果。如石油是唯一碳源時(shí)，可以抑制不能利用石油的微生物的生長(zhǎng)，使能夠利用石油的微生物生存,達(dá)到分離能消除石油污染的微生物的目的。生物適應(yīng)一定環(huán)境，環(huán)境對(duì)生物具有選擇作用.所以通過配制選擇培養(yǎng)基、控制培養(yǎng)條件等均可以選擇出目的微生物，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。原則上只有目的微生物才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng).但實(shí)際上，微生物培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物是不是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。3．顯微鏡直接計(jì)數(shù)法與稀釋涂布平板法的比較顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法是將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液放在血球計(jì)數(shù)板的載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù).由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速，但需要與血球計(jì)數(shù)板配套使用，且計(jì)數(shù)隨機(jī)性大，所以對(duì)菌體數(shù)量不能做出較為宏觀、全面的反映。平板菌落計(jì)數(shù)法通常做梯度稀釋，所以計(jì)數(shù)的線性范圍大。由于是菌懸液涂布，所以比較均勻,能較好地反映菌落的疏密程度，重復(fù)性、平行性好，是經(jīng)典的計(jì)數(shù)方法.但需要平板上長(zhǎng)出菌落一段時(shí)間后才能計(jì)數(shù),因此速度慢是最大的缺點(diǎn).4．在土壤中采集菌樣的方法與要點(diǎn)由于在土壤中幾乎可找到任何微生物，所以土壤往往是首選的采集目標(biāo)。土壤采樣必須考慮以下幾個(gè)問題:（1）土壤中有機(jī)物的含量：有機(jī)物含量高，土質(zhì)較肥，一般在其中的微生物數(shù)量較多,反之微生物數(shù)量較少。(2）采土的深度：土壤的深度不同，其通氣、養(yǎng)分和水分的分布情況也不同。表層的土壤直接受日光曝曬，故較干燥，微生物也不易大量繁殖。在離地面5～20cm處的土壤中,（3）植被情況：植被的種類與微生物的分布有著密切的關(guān)系。例如，在冬天灌水的水稻田土壤中,真菌分布得較多。（4）采土的季節(jié)：以春秋兩季為宜。這時(shí)土壤中的養(yǎng)分、水分和溫度都較適宜,微生物的數(shù)量也最多。采土?xí)r尤其應(yīng)注意土壤的含水量，水分過多會(huì)造成厭氧環(huán)境，不利于放線菌的生長(zhǎng)繁殖。真菌雖需要較高的相對(duì)濕度，但基質(zhì)中的水分卻不宜過多。因此要避免在雨季采集土樣.此外,土壤的pH也應(yīng)適當(dāng)注意,細(xì)菌和放線菌在中性或微堿性土壤中居多，而真菌則在偏酸性的土壤中較豐富。（5)采土方法：選擇好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取5～20cm處的土樣幾十克，盛入事先滅過菌的防水紙袋內(nèi)，并在上面記錄采土?xí)r間、5．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)（1)設(shè)置重復(fù)組。實(shí)驗(yàn)要有足夠的次數(shù)，才能避免結(jié)果的偶然性,使結(jié)論更有說服力與準(zhǔn)確性。如該實(shí)驗(yàn)中，可在每個(gè)稀釋度下設(shè)置3個(gè)選擇培養(yǎng)基平板；計(jì)數(shù)時(shí)在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，求平均值.這樣也可以為實(shí)驗(yàn)是否成功提供參考，如重復(fù)組結(jié)果不一致，則意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。（2）設(shè)置對(duì)照。對(duì)照的設(shè)置也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度和說服力.如在該實(shí)驗(yàn)中，可在配制培養(yǎng)基時(shí)，準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基兩種，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用，在相同的稀釋度下，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基的。另外，要設(shè)置空白對(duì)照，即在培養(yǎng)基中不加土樣，如果空白對(duì)照的培養(yǎng)基上沒有菌落生長(zhǎng),則說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。題型一選擇培養(yǎng)基的特點(diǎn)與應(yīng)用【例題1】（2009·上海高考）氯苯化合物是重要的有機(jī)化工原料，因其不易降解，會(huì)污染環(huán)境。某研究小組依照下列實(shí)驗(yàn)方案（圖1）篩選出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培養(yǎng)基配方如下表。圖1培養(yǎng)基的組成液體培養(yǎng)基蛋白胨牛肉膏氯苯氯化鈉硝酸銨無機(jī)鹽(無碳）蒸餾水Ⅰ號(hào)1055mg5——1Ⅱ號(hào)-—50mg53適量1Ⅲ號(hào)——20～80mg53適量1（1)配制Ⅱ號(hào)固體培養(yǎng)基時(shí)，除添加Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基成分外,還應(yīng)添加1%的________。(2）培養(yǎng)基配制時(shí)，滅菌與調(diào)pH的先后順序是________________________________________________________________________________。（3)從用途上來說，Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基和Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基分別屬于________培養(yǎng)基和________培養(yǎng)基。在Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基中，為SP1菌提供氮源的成分是________。（4）在營(yíng)養(yǎng)缺乏或環(huán)境惡劣時(shí)，SP1的菌體會(huì)變成一個(gè)圓形的休眠體,這種休眠體被稱為________。（5）將SP1菌接種在含不同濃度氯苯的Ⅲ號(hào)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到生長(zhǎng)曲線（如圖2）.從圖2可知，SP1菌在________培養(yǎng)條件下最早停止生長(zhǎng)，其原因是_________________________________________________________________________________________________.圖2解析：(1）固體培養(yǎng)基必須含有適量的瓊脂。（2)配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)先調(diào)pH后滅菌。（3）Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基是為了獲得更多的菌株，屬于通用培養(yǎng)基，Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基是為了選擇出SP1菌株，屬于選擇培養(yǎng)基,Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基成分中含N物質(zhì)為硝酸銨，則應(yīng)由它為SP1菌株提供氮源。（4）在惡劣環(huán)境下一些菌體會(huì)形成芽孢休眠體，來度過不良環(huán)境.(5）SP1菌株是以氯苯為碳源，當(dāng)氯苯消耗盡菌株因缺少碳源而不能繼續(xù)生存，故氯苯含量越少,SP1菌株越早停止生長(zhǎng)。答案:（1)瓊脂(2）先調(diào)pH，后滅菌(3）通用選擇硝酸銨（4）芽孢（5）20mg·L－1氯苯碳源最早耗盡題型二測(cè)定細(xì)菌數(shù)量的原理與方法【例題2】用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù),在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是（）。A．涂布了1個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230B．涂布了2個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260,取平均值238C．涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256,取平均值163D．涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233解析:在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性，所以A、B兩項(xiàng)不正確。C項(xiàng)雖涂布了3個(gè)平板,但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另兩個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地用3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值求平均值。答案:D反思領(lǐng)悟:在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板作為重復(fù)組；在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，如果結(jié)果差別過大，則意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。題型三設(shè)計(jì)微生物的選擇方案【例題3】用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對(duì)照是（）。A．未接種的選擇培養(yǎng)基 B．未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 D．接種了的選擇培養(yǎng)基解析：將菌液稀釋相同的倍數(shù),在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此,以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照。對(duì)照遵循的是單一變量原則，所以與選擇培養(yǎng)基一樣接種、培養(yǎng)。答案：C反思領(lǐng)悟：對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試的條件以外,其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)，其作用是比照實(shí)驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果.1．下列是關(guān)于“檢測(cè)土壤中細(xì)菌總數(shù)”實(shí)驗(yàn)操作的敘述，其中錯(cuò)誤的是（）.A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0。1mL，分別涂布于各組平板上C．將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板倒置,37℃恒溫培養(yǎng)24～48D．確定對(duì)照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實(shí)驗(yàn)組平板進(jìn)行計(jì)數(shù)2．若大腸桿菌和圓褐固氮菌混合在一起,采用下列哪組培養(yǎng)基可將它們分離?（)A．加食鹽的培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 B．伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基C．斜面培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 D．加青霉素的培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基3．分析下面培養(yǎng)基的配方,回答下面的問題。KH2PO41.4Na2HPO42。1MgSO4·7H2O0.2葡萄糖10.0尿素1.0瓊脂15.0用蒸餾水定容到1000mL（1）在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是________和________。（2)按物理性質(zhì)劃分該培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基，理由是培養(yǎng)基中含有________；該類培養(yǎng)基常用于微生物的純化、________和________。（3）由于培養(yǎng)基中只有尿素一種______源，所以該培養(yǎng)基只能用于能夠合成________的微生物的培養(yǎng)。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤浸出液能夠從土壤中篩選出________細(xì)菌.(4)在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，并能抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱作________培養(yǎng)基。4．（2011·課標(biāo)全國(guó)理綜）有些細(xì)菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從受原油污染的土壤中篩選出能高效降解原油的菌株。回答下列問題。（1）在篩選過程中,應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以________為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，從功能上講，該培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基.（2）純化菌種時(shí),為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即________和________.（3）為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍分解圈的大小，分解圈大說明該菌株的降解能力________________________________________________________________________。（4)通常情況下，在微生物培養(yǎng)過程中，實(shí)