免疫組織化學檢驗技術（免疫學檢驗課件）

酶免疫組織化學檢驗技術

酶免組織化學檢驗技術是在一定條件下，應用酶標抗體（抗原）與組織或細胞標本中的抗原（抗體）發(fā)生反應，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識別出標本中抗原（抗體）的分布和性質；也可通過圖像分析技術達到定量的目的。一、標本制作常用的標本有組織切片、組織印片和細胞涂片酶免組織化學檢驗技術可分為

酶標記抗體免疫組織化學染色法

非標記抗體酶免疫組織化學染色法二、酶標記抗體的免疫組化染色法（一）原理

酶標記抗體的免疫組織化學染色法是借助交聯劑的共價鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標抗體（或抗抗體）與組織內特異抗原或抗原抗體復合物反應后，通過酶對底物的催化作用，生成不溶性有色產物并沉淀在特定位置，達到對抗原定性、定位、定量檢測的目的。（二）技術類型

1.直接法形成抗原一抗體一酶復合物2.間接法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E復合物3.酶標抗體三步染色法為間接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E復合物（三）方法評價三、非標記抗體酶免疫組化染色法（一）原理該技術首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結合形成復合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3的Fc段結合，又可與結合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結合，經酶催化底物的顯色反應，達到對抗原的檢測。（二）技術類型1.酶橋法

用辣根過氧化物酶（HRP）免疫動物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經Ab2（如羊抗兔）作橋，將結合在組織抗原上的Ab1(兔抗相應組織抗原的抗體)與Ab3連接起來，最后將HRP與Ab3結合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復合物，加底物顯色2.PAP法即過氧化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良，技術要點基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過氧化物酶（AP））與酶（過氧化物酶（P））制成了可溶性復合物（PAP）,該復合物由2個抗酶抗體和3個過氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。通過橋抗體（Ab2）將特異性識別組織抗原的抗體（Ab1）與PAP復合物的抗酶抗體連接起來Ag-Ab1-Ab2-PAP3.雙橋PAP法

該法是PAP法的改良，通過兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復合物，在抗原抗體復合物上結合了比PAP法更多的酶分子，大大增強了方法的敏感性。4.APAAP法APAAP法就是以堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶（AP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡稱APAAP法。技術要點與PAP法相似。（三）方法評價該技術既可檢測抗原，又可檢測抗體。由于酶不是標記在抗體上，而是經抗原（酶）抗體反應與抗酶抗體結合，避免了酶標抗體的缺點，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAP法，是當今免疫組化技術中敏感性較高的方法。四、臨床應用

酶免疫組織化學檢驗技術主要用于組織切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測。組織切片中各類抗原性物質，如各類蛋白質、酶、激素、細胞、病毒、腫瘤抗原、漿細胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細胞表面標志等均可檢測。

親和組織化學檢驗技術

親和組織化學是利用兩種物質之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價或多價結合力的物質如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，對某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質、糖類、熒光素和酶等多種類型的大小分子結合形成相應復合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應等技術，在細胞或亞細胞水平進行對應親和物質的定位、定性或定量分析。用于親和組織化學的物質有生物素與親和素、植物凝集素與糖類、SPA與IgG、鏈霉親和素與生物素等。一、生物素-親和素法生物素又稱維生素H的小分子物質，常從卵黃和肝組織中提取。生物素可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素也稱抗生物素、卵白素，從卵白蛋白中提取的，每個親和素分子有生物素結合的4個位點，二者可牢固結合成不可逆的復合物。常用的技術類型有：1.標記親和素-生物素法（LAB法）將親和素與標記物（HRP）結合，一個親合素可結合多個HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結合，一個抗體分子可連接多個生物素分子，抗體的活性不受影響。細胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結合，繼而將標記親和素結合在抗體的生物素上，如此多層放大，提高了檢測抗原的敏感性。2.橋連親和素-生物素法（BAB法）先使抗原與生物素化的抗體結合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標生物素搭橋連接，也達到多層放大效果。3.親和素-生物素-辣根過氧化物酶復合物法（ABC法）此法是前兩種方法的改進，即先按一定比例將親和素與酶（辣根過氧化物酶）標生物素結合在一起，形成親和素-生物素-辣根過氧化物酶復合物（ABC復合物），當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時，ABC中未飽和的親和素結合部位即可與抗體上的生物素結合，最終形成晶格樣結構的復合體，其中網絡了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測抗原的靈敏度。

二、SPA法SPA具有和人及許多動物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的IgGFc結合的能力，這種結合不會影響抗體的活性。每個SPA分子可同時結合兩個IgG分子，也可一方面同IgG相結合，一方面與標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結合。三、鏈霉親和素—生物素技術鏈霉親和素與生物素的結合是已知自然界中最強的非共價相互作用之一，其功能類似親和素。利用生物素結合的二抗與酶標記的鏈霉親和