免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（免疫學(xué)檢驗(yàn)課件）

酶免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識(shí)別出標(biāo)本中抗原（抗體）的分布和性質(zhì)；也可通過(guò)圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。一、標(biāo)本制作常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可分為

酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色法

非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色法二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法（一）原理

酶標(biāo)記抗體的免疫組織化學(xué)染色法是借助交聯(lián)劑的共價(jià)鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標(biāo)抗體（或抗抗體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，通過(guò)酶對(duì)底物的催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達(dá)到對(duì)抗原定性、定位、定量檢測(cè)的目的。（二）技術(shù)類型

1.直接法形成抗原一抗體一酶復(fù)合物2.間接法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E復(fù)合物3.酶標(biāo)抗體三步染色法為間接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E復(fù)合物（三）方法評(píng)價(jià)三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法（一）原理該技術(shù)首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結(jié)合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3的Fc段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結(jié)合，經(jīng)酶催化底物的顯色反應(yīng)，達(dá)到對(duì)抗原的檢測(cè)。（二）技術(shù)類型1.酶橋法

用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）免疫動(dòng)物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經(jīng)Ab2（如羊抗兔）作橋，將結(jié)合在組織抗原上的Ab1(兔抗相應(yīng)組織抗原的抗體)與Ab3連接起來(lái)，最后將HRP與Ab3結(jié)合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復(fù)合物，加底物顯色2.PAP法即過(guò)氧化物酶（P）-抗過(guò)氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良，技術(shù)要點(diǎn)基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過(guò)氧化物酶（AP））與酶（過(guò)氧化物酶（P））制成了可溶性復(fù)合物（PAP）,該復(fù)合物由2個(gè)抗酶抗體和3個(gè)過(guò)氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。通過(guò)橋抗體（Ab2）將特異性識(shí)別組織抗原的抗體（Ab1）與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來(lái)Ag-Ab1-Ab2-PAP3.雙橋PAP法

該法是PAP法的改良，通過(guò)兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAP法更多的酶分子，大大增強(qiáng)了方法的敏感性。4.APAAP法APAAP法就是以堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶（AP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡(jiǎn)稱APAAP法。技術(shù)要點(diǎn)與PAP法相似。（三）方法評(píng)價(jià)該技術(shù)既可檢測(cè)抗原，又可檢測(cè)抗體。由于酶不是標(biāo)記在抗體上，而是經(jīng)抗原（酶）抗體反應(yīng)與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)抗體的缺點(diǎn)，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAP法，是當(dāng)今免疫組化技術(shù)中敏感性較高的方法。四、臨床應(yīng)用

酶免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測(cè)。組織切片中各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原、漿細(xì)胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細(xì)胞表面標(biāo)志等均可檢測(cè)。

親和組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

親和組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，對(duì)某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質(zhì)、糖類、熒光素和酶等多種類型的大小分子結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)等技術(shù)，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性或定量分析。用于親和組織化學(xué)的物質(zhì)有生物素與親和素、植物凝集素與糖類、SPA與IgG、鏈霉親和素與生物素等。一、生物素-親和素法生物素又稱維生素H的小分子物質(zhì)，常從卵黃和肝組織中提取。生物素可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素也稱抗生物素、卵白素，從卵白蛋白中提取的，每個(gè)親和素分子有生物素結(jié)合的4個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。常用的技術(shù)類型有：1.標(biāo)記親和素-生物素法（LAB法）將親和素與標(biāo)記物（HRP）結(jié)合，一個(gè)親合素可結(jié)合多個(gè)HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗原（或通過(guò)一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親和素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大，提高了檢測(cè)抗原的敏感性。2.橋連親和素-生物素法（BAB法）先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果。3.親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定比例將親和素與酶（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)生物素結(jié)合在一起，形成親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC復(fù)合物），當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC中未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測(cè)抗原的靈敏度。

二、SPA法SPA具有和人及許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的IgGFc結(jié)合的能力，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。每個(gè)SPA分子可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過(guò)氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。三、鏈霉親和素—生物素技術(shù)鏈霉親和素與生物素的結(jié)合是已知自然界中最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一，其功能類似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親和