免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)-化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操作流程質(zhì)量控制、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點(diǎn)一化學(xué)發(fā)光免疫分析二三四化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用五目錄化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的抗原抗體反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。該技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、分離簡(jiǎn)便、快速、試劑無(wú)毒、安全穩(wěn)定、可自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，在免疫學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。前言放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)類別標(biāo)記物底物最終檢測(cè)信號(hào)均相/非均相反應(yīng)直接化學(xué)發(fā)光免疫分析吖啶酯（AE）無(wú)光強(qiáng)度非均相反應(yīng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析HRPALP魯米諾及其衍生物AMPPD光強(qiáng)度光強(qiáng)度非均相反應(yīng)非均相反應(yīng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析三聯(lián)吡啶釕無(wú)光強(qiáng)度非均相反應(yīng)魯米諾氧途徑免疫分析激發(fā)基團(tuán)+發(fā)光基團(tuán)無(wú)光強(qiáng)度均相反應(yīng)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型化學(xué)發(fā)光與酶免的對(duì)比酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度定性/半定量測(cè)量定量測(cè)量人體傷害底物可有致癌性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目少多化學(xué)發(fā)光與放免的對(duì)比放免化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度較高高人體傷害放射性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目較多多第一節(jié)概述一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級(jí)的基態(tài)躍遷到高能級(jí)的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。1.光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光。2.生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來(lái)。3.化學(xué)發(fā)光某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光?；鶓B(tài)（低能級(jí)、穩(wěn)定）激發(fā)態(tài)（高能級(jí)、不穩(wěn)定）吸收化學(xué)能光能一個(gè)化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：①該反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能,并由某一步驟單獨(dú)提供,因?yàn)榍耙徊椒磻?yīng)釋放的能量將因振動(dòng)弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光②要有有利的反應(yīng)過(guò)程,使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)③激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學(xué)發(fā)光量子效率釋放出光子,或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子使之進(jìn)入激發(fā)態(tài)并釋放出光子在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。二.化學(xué)發(fā)光劑作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高

物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的物質(zhì)相匹配

能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物

其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果

在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性

常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有

1.直接化學(xué)發(fā)光劑

2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

3.電化學(xué)發(fā)光劑

1.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（acridinium，AE）。吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。

目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。HRP的常用的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，ALP的發(fā)光底物為金剛烷（AMPPD）（1）魯米諾或其衍生物

魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，輻射出最大發(fā)射波長(zhǎng)為425nm的光。魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理（2）AMPPD

〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕3．電化學(xué)發(fā)光劑

電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光的物質(zhì)。如化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。

用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)和磁顆粒性的抗體（抗原）發(fā)生免疫反應(yīng)后，通過(guò)磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來(lái)，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原(抗體)的含量

第二節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測(cè)原理化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖

1.分離方法

常用磁顆粒分離技術(shù)，即用抗原或抗體包被磁顆粒，與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原及吖啶酯標(biāo)記的抗體或抗原通過(guò)一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過(guò)在磁場(chǎng)中沖洗將結(jié)合到免疫復(fù)合物中的標(biāo)記物和游離標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù)。

二、方法類型2.常用的免疫學(xué)反應(yīng)模式

雙抗原夾心法固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法雙抗體夾心法三、技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)后，經(jīng)洗滌將結(jié)合物與游離的酶標(biāo)物分離后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。第三節(jié)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析一、檢測(cè)原理堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖

1.根據(jù)標(biāo)記酶不同分類可分為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析。前者常以魯米諾或其衍生物作為發(fā)光底物，后者常以AMPPD作為發(fā)光底物。

2.根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分類同化學(xué)發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法等主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標(biāo)記的是酶而不是直接標(biāo)記發(fā)光劑。

二、方法類型三、技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離

（磁顆粒分離法、微粒子捕獲法、包被聚苯乙烯反應(yīng)珠或孔分離法）酶促發(fā)光反應(yīng)

電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的抗原或抗體進(jìn)行定量分析，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測(cè)原理電化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2.免疫學(xué)反應(yīng)模式其反應(yīng)模式同發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法三種主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標(biāo)記的是三聯(lián)吡啶釕。

二、方法類型三、技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))電化學(xué)發(fā)光過(guò)程

第五節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的特點(diǎn)1.敏感度高，甚至超過(guò)RIA；2.精密度和準(zhǔn)確性均可與RIA相比；3.試劑穩(wěn)定，無(wú)毒害；4.測(cè)定耗時(shí)短；5.測(cè)定項(xiàng)目多；6.已發(fā)展成自動(dòng)化測(cè)定系統(tǒng)。1.甲狀腺激素

T3、T4、hTSH、FT4、FT3、抗TPO、甲狀腺球蛋白、抗甲狀腺球蛋白抗體等。2.生殖激素

β-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黃體激素、孕酮、雌二醇、非結(jié)合雌三醇、甲胎蛋白、睪丸酮、硫酸脫氫異雄酮。3.腎上腺/垂體激素皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、人生長(zhǎng)激素、甲狀旁腺素、促腎上腺皮質(zhì)激素。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測(cè)項(xiàng)目4.貧血因子維生素B12、葉酸、紅細(xì)胞葉酸、鐵蛋白等。5.腫瘤標(biāo)記物

AFP、CEA、PSA、游離PSA、CAl9-9、CAl25、CAl5-3等。6．感染性疾病衣原體抗原、尿衣原體抗原、衣原體抗原確認(rèn)、弓形體IgG抗體、弓形體IgM抗體、風(fēng)疹病毒IgG抗體、風(fēng)疹病毒IgM抗體、巨細(xì)胞病毒IgG抗體、巨細(xì)胞病毒IgM抗體等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測(cè)項(xiàng)目7．糖尿病胰島素、C肽等。8．心血管系統(tǒng)肌酸激酶MB同工酶、地高辛、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白-I等。9．病毒標(biāo)記物

HIVl/2Ab、HBsAg、HBsAg確認(rèn)、HBsAb、HCVAb、HAVIgM、HAVAb、HBcAb、HBclgM、HBeAg、HBeAb等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測(cè)項(xiàng)目10．骨代謝骨膠原酶、脫氧吡啶啉等。11．過(guò)敏性疾病總IgE、特異性IgE等。12．治療藥物監(jiān)測(cè)茶堿、地高辛、環(huán)孢素、巴比妥等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測(cè)項(xiàng)目化學(xué)發(fā)光是吸收了化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能使分子激發(fā)而發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測(cè)微量抗原或抗體的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，分為直接化學(xué)發(fā)光免疫分析，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。小結(jié)教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操作流程質(zhì)量控制、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點(diǎn)一化學(xué)發(fā)光免疫分析二三四化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用五目錄化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的抗原抗體反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。該技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、分離簡(jiǎn)便、快速、試劑無(wú)毒、安全穩(wěn)定、可自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，在免疫學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。前言放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)類別標(biāo)記物底物最終檢測(cè)信號(hào)均相/非均相反應(yīng)直接化學(xué)發(fā)光免疫分析吖啶酯（AE）無(wú)光強(qiáng)度非均相反應(yīng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析HRPALP魯米諾及其衍生物AMPPD光強(qiáng)度光強(qiáng)度非均相反應(yīng)非均相反應(yīng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析三聯(lián)吡啶釕無(wú)光強(qiáng)度非均相反應(yīng)魯米諾氧途徑免疫分析激發(fā)基團(tuán)+發(fā)光基團(tuán)無(wú)光強(qiáng)度均相反應(yīng)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型化學(xué)發(fā)光與酶免的對(duì)比酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度定性/半定量測(cè)量定量測(cè)量人體傷害底物可有致癌性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目少多化學(xué)發(fā)光與放免的對(duì)比放免化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度較高高人體傷害放射性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目較多多第一節(jié)概述一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級(jí)的基態(tài)躍遷到高能級(jí)的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。1.光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光。2.生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來(lái)。3.化學(xué)發(fā)光某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。基態(tài)（低能級(jí)、穩(wěn)定）激發(fā)態(tài)（高能級(jí)、不穩(wěn)定）吸收化學(xué)能光能一個(gè)化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：①該反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能,并由某一步驟單獨(dú)提供,因?yàn)榍耙徊椒磻?yīng)釋放的能量將因振動(dòng)弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光②要有有利的反應(yīng)過(guò)程,使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)③激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學(xué)發(fā)光量子效率釋放出光子,或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子使之進(jìn)入激發(fā)態(tài)并釋放出光子在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。二.化學(xué)發(fā)光劑作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高

物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的物質(zhì)相匹配

能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物

其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果

在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性

常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有

1.直接化學(xué)發(fā)光劑

2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

3.電化學(xué)發(fā)光劑

1.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（acridinium，AE）。吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。

目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。HRP的常用的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，ALP的發(fā)光底物為金剛烷（AMPPD）（1）魯米諾或其衍生物

魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，輻射出最大發(fā)射波長(zhǎng)為425nm的光。魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理（2）AMPPD

〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕3．電化學(xué)發(fā)光劑

電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光的物質(zhì)。如化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。

教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操作流程質(zhì)量控制、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點(diǎn)一化學(xué)發(fā)光免疫分析二三四化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用五目錄化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)和磁顆粒性的抗體（抗原）發(fā)生免疫反應(yīng)后，通過(guò)磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來(lái)，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原(抗體)的含量。

第二節(jié)直接化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測(cè)原理YYY被測(cè)抗原+抗體+帶吖啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）發(fā)光磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖1.分離方法

常用磁顆粒分離技術(shù)，即用抗原或抗體包被磁顆粒，與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原及吖啶酯標(biāo)記的抗體或抗原通過(guò)一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過(guò)在磁場(chǎng)中沖洗將結(jié)合到免疫復(fù)合物中的標(biāo)記物和游離標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù)。

二、方法類型2.常用的免疫學(xué)反應(yīng)模式

雙抗原夾心法固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法雙抗體夾心法三、技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操作流程質(zhì)量控制、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點(diǎn)一化學(xué)發(fā)光免疫分析二三四化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用五目錄化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)后，經(jīng)洗滌將結(jié)合物與游離的酶標(biāo)物分離后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。第三節(jié)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析一、檢測(cè)原理堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖

1.分配樣品,磁顆粒和試劑2.孵育使反應(yīng)物結(jié)合3.在磁場(chǎng)中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)4.加入底物產(chǎn)生信號(hào)5.孵育,促使信號(hào)的產(chǎn)生6.信號(hào)檢測(cè)分析步驟二、方法類型標(biāo)記酶不同HRP標(biāo)記的CLEIAALP標(biāo)記的CLEIA免疫學(xué)反應(yīng)模式雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法三、技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離

（磁顆粒分離法、微粒子捕獲法、包被聚苯乙烯反應(yīng)珠或孔分離法）酶促發(fā)光反應(yīng)

教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操作流程質(zhì)量控制、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點(diǎn)一化學(xué)發(fā)光免疫分析二三四化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用五目錄化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的抗原或抗體進(jìn)行定量分析，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測(cè)原理電化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2.免疫學(xué)反應(yīng)模式其反應(yīng)模式同發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法三種主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標(biāo)記的是三聯(lián)吡啶釕。

二、方法類型三、技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))電化學(xué)發(fā)光過(guò)程

教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操作流程質(zhì)量控制、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點(diǎn)一化學(xué)發(fā)光免疫分析二三四化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用五目錄化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析第五節(jié)發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)（LOCI）LOCI檢測(cè)體系中的三種試劑123覆蓋有親和素和酞菁染料的乳膠聚苯乙烯微粒，可以吸收680nm的光，生成高能單線態(tài)氧。發(fā)光微粒含有烯烴染料和特異性抗體（抗原），可以與單線態(tài)氧反應(yīng)，放出612nm光信號(hào)。復(fù)合物釋放的化學(xué)光在612nm被LOCI檢測(cè)器讀取。只有兩種粒子形成二聚體才能生成化學(xué)光信?？梢耘c含有親和素的感光微粒結(jié)合發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)原理高能單線態(tài)氧2.免疫學(xué)反應(yīng)模式二、方法類型雙抗體夾心法雙抗原競(jìng)爭(zhēng)法1.分離方法均相技術(shù)三、技術(shù)要點(diǎn)step1抗原抗體反應(yīng)step2魯米諾氧途徑化學(xué)發(fā)光反應(yīng)step3化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操