微生物學(xué)檢驗技術(shù) 課件 8項目八：染色標(biāo)本檢查

項目八染色標(biāo)本檢查學(xué)習(xí)目標(biāo)1．掌握革蘭染色和抗酸染色的原理、操作及結(jié)果判斷。2．熟悉細菌染色標(biāo)本檢查的一般程序。3．了解特殊結(jié)構(gòu)染色法和負染色法。4．能夠正確使用光學(xué)顯微鏡油鏡觀察細菌。5．嚴格執(zhí)行無菌操作，注意生物安全。項目八染色標(biāo)本檢查思維導(dǎo)圖項目八染色標(biāo)本檢查一、染色標(biāo)本檢查的一般程序項目八染色標(biāo)本檢查只用一種染料對細菌進行染色的方法主要用于觀察細菌的大小、形態(tài)和排列方式。常用的染料有亞甲藍、結(jié)晶紫、石炭酸復(fù)紅等堿性染料。染色方法為：細菌標(biāo)本經(jīng)涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分鐘，水洗后待玻片干燥后即可在顯微鏡下進行觀察。一、染色標(biāo)本檢查的一般程序（一）單染色法（二）復(fù)染色法用兩種或兩種以上的染料對細菌進行染色的方法。既可以觀察細菌的大小、形態(tài)與排列方式，又能鑒別細菌的染色性。最常用的是革蘭染色法。細菌染色的一般程序：

涂片--干燥--固定--初染—媒染--脫色--復(fù)染一、染色標(biāo)本檢查的一般程序二、常用染色方法項目八染色標(biāo)本檢查細菌革蘭染色是由丹麥病理學(xué)家ChristainGram于1884年創(chuàng)立的一種染色技術(shù)，后經(jīng)學(xué)者改進一直沿用至今，是細菌檢驗平臺經(jīng)常使用而不可或缺的檢驗技術(shù)之一。通過革蘭染色可以將細菌分為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-），不僅為分類鑒定提供依據(jù)，而且能夠指導(dǎo)臨床用藥。二、常用染色方法（一）革蘭染色法滲透學(xué)說G+菌細胞壁結(jié)構(gòu)致密，脂類含量少G-菌細胞壁較疏松，脂類物質(zhì)多化學(xué)學(xué)說G+菌細胞內(nèi)含大量核糖核酸鎂鹽G-菌含核糖核酸鎂鹽少等電點學(xué)說G+菌等電點低，pH2-3G-菌等電點高，pH4-5二、常用染色方法（一）革蘭染色法1.革蘭染色原理結(jié)晶紫染液1盧戈氏碘液295%酒精3稀釋石炭酸復(fù)紅4二、常用染色方法（一）革蘭染色法2.革蘭染液配置結(jié)晶紫10g95%酒精100mlA液草酸銨1g蒸餾水100mlB液結(jié)晶紫乙醇飽和溶液100ml1%草酸銨水溶液100mlA液20mlB液80ml結(jié)晶紫染液100ml二、常用染色方法（一）革蘭染色法（1）結(jié)晶紫染液碘化鉀2g蒸餾水100ml碘化鉀水溶液100ml碘1g蒸餾水200ml盧戈氏碘液300ml二、常用染色方法（一）革蘭染色法（2）盧戈碘液95%酒精

直接購買成品，不需要配制二、常用染色方法（一）革蘭染色法（3）脫色液堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液100ml取飽和液10ml稀釋石炭酸復(fù)紅染液100ml堿性復(fù)紅1g95%乙醇10ml5%石炭酸90ml蒸餾水90ml二、常用染色方法（一）革蘭染色法（4）稀釋石炭酸復(fù)紅染液制片涂片干燥固定染色初染酶染脫色復(fù)染鏡檢油鏡觀察二、常用染色方法（一）革蘭染色法3.革蘭染色操作步驟初染（1min）媒染（1min）脫色（30-60s）復(fù)染（1min）吸去殘水晾干水洗水洗水洗水洗二、常用染色方法（一）革蘭染色法二、常用染色方法（一）革蘭染色法4.革蘭染色注意事項在進行革蘭染色時特別要注意酒精脫色這一步，把握好脫色的時間。嚴格把握被檢菌的培養(yǎng)時間，避免出現(xiàn)錯誤的染色結(jié)果。水洗時要用細流水沖洗。革蘭染色時涂片不宜太厚也不宜太薄?？刂坪妹恳徊饺旧臅r間。革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌二、常用染色方法（一）革蘭染色法5.革蘭染色結(jié)果6.革蘭染色實際意義鑒別細菌指導(dǎo)選擇藥物分析致病性二、常用染色方法（二）抗酸染色法分枝桿菌屬的細菌，如結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌，細胞壁中含有大量類脂（如分枝菌酸），使菌體不易著色，一般不用革蘭氏染色?？顾崛旧ㄊ翘禺愋缘蒯槍Ψ种U菌屬細菌的鑒別染色法?？顾崛旧栃缘募毦Q為抗酸桿菌。

分枝桿菌的細胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色。細胞成分二、常用染色方法（二）抗酸染色法1.抗酸染色原理

分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱或者延長染色時間來促使其與石炭酸復(fù)紅染液結(jié)合而著色。著色特點

分枝桿菌細胞結(jié)構(gòu)中的分枝菌酸與染料結(jié)合牢固，一旦結(jié)合以后，就很難被酸性脫色劑脫色。難以脫色二、常用染色方法（二）抗酸染色法2.結(jié)果判斷和報告結(jié)核桿菌染成紅色，細長、直的或微彎曲桿菌，偶爾有桿菌著色不均，呈顆粒狀者。標(biāo)本的其余部分及非抗酸性細菌染成藍色。必須逐一觀察各個視野，直到整個涂片找不到結(jié)核桿菌時，方可報告“未找到結(jié)核桿菌”。石炭酸復(fù)紅染液13%鹽酸酒精2堿性美藍染液3二、常用染色方法（二）抗酸染色法3.萋－尼抗酸染色液的配制堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液100ml取飽和液10ml石炭酸復(fù)紅染液100ml堿性復(fù)紅1g95%乙醇10ml5%石炭酸90ml5%石炭酸90ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（1）石炭酸復(fù)紅液濃鹽酸3ml95%乙醇97ml3%鹽酸酒精100ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（2）3%鹽酸酒精液美藍酒精飽和溶液100ml取飽和液30ml美藍染液130ml美藍2g95%酒精100ml0.01%KOH100ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（3）呂氏美藍染色液厚涂片取標(biāo)本在干凈的載玻片上涂片，制成20mm×15mm大小的厚膜涂片。干燥自然干燥，讓玻片上的水分揮發(fā)。固定玻片在酒精燈火焰外焰，以鐘擺的速度通過火焰三次固定。二、常用染色方法（二）抗酸染色法（1）制片4.抗酸染色操作步驟初染石炭酸復(fù)紅，冷染或熱染脫色3%鹽酸酒精復(fù)染堿性美藍二、常用染色方法（二）抗酸染色法（2）染色二、常用染色方法（二）抗酸染色法（3）鏡檢二、常用染色方法（二）抗酸染色法每張載玻片只允許涂1份標(biāo)本，不得涂2份或2份以上標(biāo)本，以免染色過程中菌體脫落而導(dǎo)致陰陽結(jié)果混淆。抗酸染色的涂片要略厚，加溫時隨時補加染色液?？顾崛旧珪r，脫色劑脫色時間寧長勿短。注意生物安全。5.抗酸染色注意事項臨床意義鑒別細菌確定分枝桿菌感染程度判定分枝桿菌感染預(yù)后二、常用染色方法（二）抗酸染色法6.抗酸染色意義三、其他染色方法項目八染色標(biāo)本檢查三、其他染色方法（一）特殊染色法石炭酸復(fù)紅法制片后滴加石炭酸復(fù)紅染液，小火加熱染料出現(xiàn)蒸汽約5分鐘，冷后沖洗，用95%乙醇脫色2分鐘，水洗，堿性亞甲藍復(fù)染半分鐘，水洗待干后鏡檢。芽胞呈紅色，菌體呈藍色。孔雀綠法制片后滴加5%孔雀綠，小火加熱染料出現(xiàn)蒸汽15～20分鐘，冷后沖洗，直至流出的水中無染色液為止，0.5%石炭酸復(fù)紅復(fù)染5分鐘，水洗待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。注意生物安全。1.芽胞染色三、其他染色方法（一）特殊染色法將新載玻片浸泡在95%的乙醇中，臨用時取出用干凈紗布擦干，滴1滴蒸餾水于玻片中央，用接種環(huán)挑取少許菌落點在蒸餾水滴頂部，置35℃孵箱自然干燥，滴加鞭毛染液染色1～2分鐘，輕輕水洗（切勿用力太猛），自然干燥后鏡檢。鞭毛和菌體呈紅紫色。2.鞭毛染色三、其他染色方法（一）特殊染色法制片后滴加結(jié)晶紫染液，在酒精燈上稍微加熱至出現(xiàn)蒸汽為止，用200g/L的硫酸銅溶液沖洗染液（切勿用水洗），吸水紙吸干后鏡檢。菌體及背景呈紫色，菌體周圍有一圈未著色的透明帶。3.莢膜染色三、其他染色方法（一）特殊染色法4.異染顆粒染色制片后滴加A液（甲苯胺藍和孔雀綠的乙醇溶液）3～5分鐘后水洗，滴加B液（碘化鉀溶液）1分鐘后水洗吸干鏡檢。菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色。三、其他染色方法（二）負染色法背景著色而菌體本身不著色的染色方法。實際工作中常用墨汁復(fù)染色法來觀察真菌及細菌莢膜。如新生隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。三、其他染色方法（三）熒光染色法熒光染色是用能夠發(fā)熒光的物質(zhì)對標(biāo)本進行染色，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。目前主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等病原菌的檢測。如痰標(biāo)本經(jīng)金胺O染色后，在熒光顯微鏡下觀察到金黃色熒光菌體。在普通光學(xué)顯微鏡下，可清楚地觀察染色標(biāo)本中細菌的形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)，并可根據(jù)染色反應(yīng)性對細菌加以分類鑒定。用于細菌的染料主要有堿性和酸性兩大類，細菌易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，常用的堿性染料主要有堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍等。細菌染色是常用的細菌形態(tài)檢查法，分為單