醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)一-免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白

免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白

實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)原理免疫球蛋白(Ig)是指一類(lèi)具有抗體樣結(jié)構(gòu)或具有抗體活性的球蛋白，能與誘導(dǎo)其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，是體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子。血清免疫球蛋白(Ig)的測(cè)定是檢查體液免疫功能最常用的方法。通常檢測(cè)IgG、IgM、IgA，這三類(lèi)Ig就可以代表血清Ig的水平。疾病評(píng)估免疫球蛋白：是廣泛存在于哺乳動(dòng)物血清、淋巴液、組織液和外分泌液中的一種具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。抗體：是B細(xì)胞接受抗原刺激后分泌的具有免疫功能的，即能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。所有的抗體都是免疫球蛋白，而免疫球蛋白并不都是抗體。多發(fā)性骨髓瘤病人血清中的免疫球蛋白，雖然其化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似，但通常無(wú)免疫功能，不易查到抗體活性，因此不能稱(chēng)之為抗體。免疫球蛋白(Ig)與抗體(Ab)的區(qū)別IgG

在正常人血清中含量最多，是體液中最重要的抗病原微生物的抗體（生理），自身免疫病中自身抗體（病理）IgA

抗菌、抗毒素、抗病毒IgM

高能效的抗微生物抗體，感染早期出現(xiàn)IgD

其改變與某些感染和變態(tài)反應(yīng)性疾病相關(guān)IgE血清中含量最少的抗體，可以引起I型超敏反應(yīng)。參與過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘和濕疹等發(fā)病機(jī)制調(diào)節(jié)的主要抗體五類(lèi)免疫球蛋白：（1）幾種不同的Ig水平增加：主要見(jiàn)于感染、腫瘤、自身免疫病、慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化及淋巴瘤等。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)以lgG、lgA或者lgG

、IgM升高多見(jiàn)，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以lgG

、IgM升高多見(jiàn)。（2）單一的Ig水平增加：主要見(jiàn)于多發(fā)性骨髓瘤(MM)，表現(xiàn)為僅有某一種Ig異常增高，而其他種明顯降低或維持正常。其中以IgG型MM最常見(jiàn)，血清中l(wèi)gG含量可高達(dá)70g/L，IgA型次之，IgD型較少見(jiàn)，IgE型最為罕見(jiàn)。巨球蛋白血癥，是產(chǎn)生IgM的漿細(xì)胞惡性增生，血清中IgM可高達(dá)20g/L以上。血清中免疫球蛋白異常，主要可分為三類(lèi)：正常參考值：IgG8.0～16.0g/LlgA0.7～3.3g/LIgM0.5～2.2g/L（3）一種或多種Ig水平減少：分為原發(fā)性或繼發(fā)性的，前者屬于遺傳性，如瑞士丙種球蛋白缺乏癥，選擇性IgA、IgM缺乏癥等。繼發(fā)性缺損見(jiàn)于網(wǎng)狀淋巴系統(tǒng)的惡性疾病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、腎病綜合征、大面積燒傷燙傷患者、長(zhǎng)期大劑量使用免疫抑制劑或放射線照射所致。★免疫電泳

★免疫擴(kuò)散★免疫比濁檢測(cè)血清等體液標(biāo)本中免疫球蛋白的方法：★酶聯(lián)免疫測(cè)定合適比例的抗原抗體形成的免疫復(fù)合物，在PEG(聚乙二醇)作用下形成微粒，使樣品濁度發(fā)生變化。當(dāng)一定波長(zhǎng)光線通過(guò)濁度發(fā)生變化的反應(yīng)混合物時(shí)，由于被不溶性免疫復(fù)合物吸收而減弱，故在一定范圍內(nèi)吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)。當(dāng)抗體濃度固定，樣品的濁度與其中所含抗原量成正比。免疫比濁：聚乙二醇(PEG)是中性、無(wú)毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相溶性的高分子聚合物，具有高度的親水性，可以促進(jìn)免疫復(fù)合物形成微粒，沒(méi)有免疫原性。在免疫反應(yīng)中，為增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)常使用增聚劑，3-4％的PEG，可破壞抗原抗體的水化層，促進(jìn)抗原抗體靠近反應(yīng)，但如濃度不適合，過(guò)高，會(huì)影響其它溶質(zhì)或產(chǎn)生非特異性聚集影響結(jié)果。

免疫比濁法分類(lèi)免疫比濁法當(dāng)一束光線通過(guò)溶液受到光散射和光吸收兩個(gè)因素的影響而使光的強(qiáng)度減弱透射比濁法:測(cè)定入射光因反射、吸收或散射后的衰減散射比濁法：光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，測(cè)定光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)檢測(cè)器檢測(cè)器光源透鏡濾光片平光線散射光透射光

θ散射比濁、透射比濁光路圖透射比濁法（Transmissiontubidimetry）當(dāng)一定波長(zhǎng)光線通過(guò)濁度發(fā)生變化的反應(yīng)混合物時(shí)，由于被不溶性免疫復(fù)合物吸收而減弱，在一定范圍內(nèi)吸光度與免疫復(fù)合物量成正比。散射比濁法（Nephelometry）

光線通過(guò)檢測(cè)溶液時(shí)，被其中所含的抗原抗體復(fù)合物折射而部分偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光，其強(qiáng)度與復(fù)合物的數(shù)量和散射夾角成正比，與光的波長(zhǎng)成反比。兩種方法檢測(cè)原理：Ab足量，與Ag成正比透射比濁法與散射比濁法優(yōu)缺點(diǎn)★透射比濁操作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開(kāi)展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)。★散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。樣本中IgA、IgG、IgM與試劑中特異性抗體結(jié)合

不溶性免疫復(fù)合物

反應(yīng)液產(chǎn)生濁度濁度與樣本中IgA、IgG、IgM的濃度成正比在合適光波長(zhǎng)（Xnm）處測(cè)吸光度概括實(shí)驗(yàn)材料免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)測(cè)定試劑(試劑1[PEG]，試劑2[羊抗人IgA,IgG]）免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)校準(zhǔn)品，蒸餾水，血清樣本微量加樣槍、試管酶標(biāo)儀、水浴箱學(xué)生3排，第一排做A-IgA，后兩排做G-IgG實(shí)驗(yàn)步驟37℃水浴5分鐘IgG試劑1（250ul）IgA試劑1（150ul）蒸餾水2ul校準(zhǔn)品2ul樣本2ul蒸餾水3ul校準(zhǔn)品3ul樣本3ul混勻37℃水浴5分鐘IgG試劑2（85ul）IgA試劑2（50ul)OD

700nmOD

700nm試劑1：tris緩沖液，PEG；試劑2：tris緩沖液，羊抗人抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ig濃度（g/L）=×Ig校準(zhǔn)濃度（g/L）樣本管吸光度校準(zhǔn)管吸光度