光譜分析技術(shù)課件

第一節(jié)光譜分析技術(shù)精選ppt課件20212學(xué)習(xí)目標(biāo)1.能說(shuō)出臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常用分析技術(shù)名稱2.掌握光的吸收定律,理解吸光系數(shù)的意義和應(yīng)用3.敘述分光光度技術(shù)的定量測(cè)定方法4.知道火焰光度法、比濁法、原子吸收分光光度法熒光分析法的原理、影響因素和主要應(yīng)用精選ppt課件20213是能的一種表現(xiàn)形式,是電磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播,在不同的介質(zhì)處發(fā)生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等現(xiàn)象?？捎貌ㄩL(zhǎng)、頻率、傳播速度等參量來(lái)描述即光具有“波動(dòng)性”。光的顏色即由光的波長(zhǎng)決定,人眼能感覺(jué)到的光稱為可見光,其波長(zhǎng)在400～750nm之間。在可見光之外是紅外光760~1000nm紫外光200~400nm光精選ppt課件20214什么是光譜分析技術(shù)？光的波長(zhǎng)（λ）單位用納米（nm）各種化學(xué)物質(zhì)都具有一定的光譜特性,表現(xiàn)在能選擇性吸收、發(fā)射或散射某種波長(zhǎng)的光。利用物質(zhì)的吸收光譜、發(fā)射光譜或散射光譜特征對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的技術(shù)稱為光譜分析技術(shù)。精選ppt課件20215光譜分析技術(shù)原理:利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。光譜分析技術(shù)分類:發(fā)射光譜分析技術(shù):火焰光度法、熒光法吸收光譜分析技術(shù):紫外、紅外、原子、可見光分光光度法散射光譜分析技術(shù):比濁法精選ppt課件20216一、分光光度技術(shù)的基本原理許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無(wú)顏色的化合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質(zhì)。實(shí)踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通過(guò)比較溶液顏色深淺的方法來(lái)確定有色溶液的濃度，對(duì)溶液中所含的物質(zhì)進(jìn)行定量分析?；诒容^顏色深淺對(duì)溶液進(jìn)行定量分析的方法稱為比色分析法。

光子的能量與波長(zhǎng)的關(guān)系為E=hυ=hc／λ式中E為光子的能量（J:焦耳），υ為頻率，h為普朗克常數(shù)（6.63×10-34J?S），c為光速，λ為光的波長(zhǎng)因此，不同波長(zhǎng)的光，其能量不同，短波能量大，長(zhǎng)波能量小。精選ppt課件20217光的顯色原理若把某兩種顏色的光，按一定的強(qiáng)度比例混合，能夠得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補(bǔ)色。圖中處于直線關(guān)系的兩種光為互補(bǔ)色。如綠光和紫光為互補(bǔ)色，黃光和藍(lán)光為互補(bǔ)色等等。各種溶液會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色，其原因是溶液中有色質(zhì)點(diǎn)（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實(shí)驗(yàn)證明:溶液所呈現(xiàn)的顏色是其主要吸收光的互補(bǔ)色。如一束白光通過(guò)高錳酸鉀溶液時(shí)，綠光大部分被選擇吸收，其它的光透過(guò)溶液。從互補(bǔ)色示意圖可以看出，透過(guò)光中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀溶液呈紫色。精選ppt課件20218（二）光的吸收定律溶液顏色的深淺與濃度之間的關(guān)系可以用吸收定律來(lái)描述。它是由約翰·海因里?！だ什蛫W古斯特·比爾相結(jié)合而成的,所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計(jì)也符合這個(gè)定律。溶液對(duì)光的吸收當(dāng)一束強(qiáng)度為I的平行單色光照到溶液時(shí),一部分光被溶液吸收,一部分光被界面散射,其余的光則透過(guò)溶液,如圖所示精選ppt課件20219結(jié)論:I0=Ia+Ir+ItI0--入射光強(qiáng)度Ia--吸收光強(qiáng)度Ir--反射光強(qiáng)度It--透射光強(qiáng)度通常由于Ir很小可忽略不計(jì)，上式可簡(jiǎn)化為I0=Ia+It透射光It與入射光強(qiáng)度I0之比為透光率或透光度，用T表示:T=It/I0透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度或光密度或消光度，用A表示:A=－lgT=lg1/T=lgI0/It藍(lán)色I(xiàn)白光I0I黃光taIr精選ppt課件202110吸光度越大，表示該物質(zhì)對(duì)光的吸收越強(qiáng)。透光度和吸光度都是用來(lái)表示入射光被吸收的程度，它們之間可據(jù)式相互換算。

實(shí)驗(yàn)證明:單色光經(jīng)過(guò)有色溶液時(shí)，透過(guò)溶液的光強(qiáng)度不僅與溶液的濃度有關(guān)，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對(duì)光的吸收性能有關(guān)。其規(guī)律可用下式表示為A＝KCL

式中:A——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K——某溶液的消光（吸收）系數(shù)；C——溶液的濃度；L——光程，即溶液的厚度。Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。精選ppt課件202111

分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)可見光光度計(jì)721、721-A.722、723型分光光度計(jì)等紫外分光光度計(jì)751、752、753型分光光度計(jì)等紫外-可見分光光度計(jì)貝克曼DU500系列紫外/分光光度計(jì)精選ppt課件202112吸光（消光）系數(shù)表達(dá)式吸光系數(shù)Aa表示a=C（g/L）.L(cm)單位L/g.cm摩爾消光系數(shù)Aε表示ε=C（mol/L）.L(cm)單位L/mol.cm百分消光系數(shù)AE表示E=C（g/dl）.L(cm)單位是dL/(g.cm)摩爾消光系數(shù)與百分消光系數(shù)的換算關(guān)系:ε=E*M（摩爾質(zhì)量）10mol1cm,入1%1cm,入mol1cm,入1%1cm,入精選ppt課件202113一、儀器基本組成光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示精選ppt課件202114可見分光光度計(jì)精選ppt課件202115722型分光光度計(jì)示意圖精選ppt課件202116722型分光光度計(jì)使用方法（1）預(yù)熱儀器將選擇開關(guān)置于“T”,打開電源開關(guān),使儀器預(yù)熱20分鐘。為了防止光電管疲勞,不要連續(xù)光照,預(yù)熱儀器時(shí)和不測(cè)定時(shí)應(yīng)將試樣室蓋打開,使光路切斷。（2）選定波長(zhǎng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)手輪,調(diào)至所需要的單色波長(zhǎng)。（3）固定靈敏度檔在能使空白溶液很好地調(diào)到“100%”的情況下,盡可能采用靈敏度較低的擋,使用時(shí),首先調(diào)到“1”擋,靈敏度不夠時(shí)再逐漸升高。但換擋改變靈敏度后,須重新校正“0%”和“100%”。選好的靈敏度,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不要再變動(dòng)。（4）調(diào)節(jié)T=0%輕輕旋動(dòng)“0%”旋鈕,使數(shù)字顯示為“00.0”（此時(shí)試樣室是打開的）。（5）調(diào)節(jié)T=100%將盛蒸餾水（或空白溶液,或純?nèi)軇┑谋壬蠓湃氡壬笞苤械牡谝桓駜?nèi),并對(duì)準(zhǔn)光路,把試樣室蓋子輕輕蓋上,調(diào)節(jié)透過(guò)率“100%”旋鈕,使數(shù)字顯示正好為“100.0”。（6）吸光度的測(cè)定將選擇開關(guān)置于“A”,蓋上試樣室蓋子,將空白液置于光路中,調(diào)節(jié)吸光度調(diào)節(jié)旋鈕,使數(shù)字顯示為“.000”。將盛有待測(cè)溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格內(nèi),蓋上試樣室蓋,輕輕拉動(dòng)試樣架拉手,使待測(cè)溶液進(jìn)入光路,此時(shí)數(shù)字顯示值即為該待測(cè)溶液的吸光度值。讀數(shù)后,打開試樣室蓋,切斷光路。重復(fù)上述測(cè)定操作1～2次,讀取相應(yīng)的吸光度值,取平均值。（7）濃度的測(cè)定選擇開關(guān)由“A”旋置“C”,將已標(biāo)定濃度的樣品放入光路,調(diào)節(jié)濃度旋鈕,使得數(shù)字顯示為標(biāo)定值,將被測(cè)樣品放入光路,此時(shí)數(shù)字顯示值即為該待測(cè)溶液的濃度值。（8）關(guān)機(jī)實(shí)驗(yàn)完畢,切斷電源,將比色皿取出洗凈,并將比色皿座架用軟紙擦凈。精選ppt課件202117注意事項(xiàng)（1）為了防止光電管疲勞,不測(cè)定時(shí)必須將試樣室蓋打開,使光路切斷,以延長(zhǎng)光電管的使用壽命。（2）取拿比色皿時(shí),手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,而不能碰比色皿的光學(xué)表面。（3）比色皿不能用堿溶液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗滌,也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附著的水或溶液應(yīng)用擦鏡紙或細(xì)而軟的吸水紙吸干,不要擦拭,以免損傷它的光學(xué)表面。精選ppt課件202118一、標(biāo)準(zhǔn)曲線法步驟:（1）先配制五種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液。（2）測(cè)出每種溶液的吸光度A。（3）做A～C標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖所示。

有了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線便可對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)量。在同樣的條件下，用儀器測(cè)出A后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得被測(cè)溶液的濃度值Cx。A-C曲線的數(shù)學(xué)表達(dá)式:y=ax+by:吸光度x:濃度a:斜率b:截距分光光度技術(shù)的定量方法精選ppt課件202119制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn):（1）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等）,應(yīng)重新繪制。（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度,標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線性范圍時(shí),應(yīng)將樣本稀釋后再測(cè)定。（4）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。精選ppt課件2021202.對(duì)比法（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法）己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為:Cu=(Au×Cs)/As其中Cu和Au為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。精選ppt課件202121火焰光度法Na+、K+測(cè)定可采用火焰光度法。原理:火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時(shí)發(fā)射的光譜強(qiáng)度進(jìn)行含量分析。火焰光度法定量關(guān)系I=ac式中,I--特征譜線強(qiáng)度;c--待測(cè)物濃度;a--與元素激發(fā)電位、溫度及試樣成份有關(guān)的參數(shù);用火焰作為激發(fā)光源時(shí),因燃燒穩(wěn)定,且組份在火焰中分散度好,此時(shí)a為常數(shù);b--自吸情況參數(shù),當(dāng)C很低時(shí),b=1。此時(shí),自吸現(xiàn)象可忽略，則:I=ac該法可檢測(cè)血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)參法，優(yōu)點(diǎn):結(jié)果準(zhǔn)確可靠，廣為臨床采用醫(yī)學(xué)教`育網(wǎng)搜集整理。通常采用的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法。內(nèi)標(biāo)法:標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素進(jìn)行測(cè)定，一般是加入鋰內(nèi)標(biāo)，測(cè)定的是鋰/鈉或鋰/鉀電流的比值，而不是單獨(dú)的鈉或鉀的電流，這樣，可減小燃?xì)夂突鹧鏈囟炔▌?dòng)等因素引起的誤差，因而有較好的準(zhǔn)確性。b精選ppt課件202122比濁分析法比濁分析法（濁度法），屬于散射光譜分析。原理:當(dāng)光線通過(guò)一個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測(cè)定光吸收量的方法稱為比濁分析法臨床應(yīng)用:最多是免疫比濁法利用抗原抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)測(cè)定復(fù)合物形成量的多少，對(duì)抗原抗體進(jìn)行定量的方法。特點(diǎn):（1）要有特異性的抗體（2）抗原抗體的比例要適當(dāng)（3）溶液介質(zhì)的PH、離子強(qiáng)度等要適宜。影響因素:1.懸濁液的散射光強(qiáng)度主要和顆粒的數(shù)量有關(guān)2.注意掌握反應(yīng)溫度3.溶液的PH值可影響沉淀的形成及顆粒的大小4.懸濁液的穩(wěn)定性較差，需及時(shí)比濁5.稀釋緩沖液中的電解質(zhì)與非電解質(zhì)對(duì)免疫復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性有影響6.適當(dāng)選擇濾光片或入射光波長(zhǎng)精選ppt課件202123原子吸收分光光度法原理:又稱原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中待測(cè)元素的基態(tài)原子對(duì)其共振輻射的吸收強(qiáng)度來(lái)測(cè)定試樣中該元素含量的一種儀器分析方法。它是測(cè)定痕量和超痕量元素的有效方法。特點(diǎn):具有靈敏度高、干擾較少、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、應(yīng)用范圍廣、儀器比較簡(jiǎn)單、價(jià)格較低廉等優(yōu)點(diǎn)，而且可以使整個(gè)操作自動(dòng)化，因此近年來(lái)發(fā)展迅速，是應(yīng)用廣泛的一種儀器分析新技術(shù)。方法:在溫度吸收光程，進(jìn)樣方式等實(shí)驗(yàn)條件固定時(shí)，樣品產(chǎn)生的待測(cè)元素相基態(tài)原子對(duì)作為銳線光源的該元素的空心陰極燈所輻射的單色光產(chǎn)生吸收，其吸光度（A）與樣品中該元素的濃度（C）成正比。即A=KC式中，K為常數(shù)。據(jù)此，通過(guò)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液及未知溶液的吸光度，又巳知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，可作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知液中待測(cè)元素濃度。應(yīng)用:主要適用樣品中微量及痕量組分分析。精選ppt課件202124熒光分析法定義:利用某些物質(zhì)被紫外光照射后所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以進(jìn)行定性或定量分析的方法。原理:物質(zhì)的分子吸收紫外光或可見光后，由電子基態(tài)能級(jí)躍遷至激發(fā)態(tài)能級(jí)。處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，通過(guò)各種方式失去能量，返回基態(tài)。若分子首