生物制藥工藝學(xué)第二節(jié)蛋白多肽藥物2007

多肽蛋白類(lèi)藥物多肽類(lèi)藥物分類(lèi)：多肽激素垂體多肽激素促皮質(zhì)素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激素（LPH）催產(chǎn)素（OT），加壓素（AVP）等下丘腦激素促甲狀腺激素釋放激素（TRH）、生長(zhǎng)素抑制激素（GRIF）、促性腺激素釋放激素（LHRH）甲狀腺激素甲狀旁腺激素（PTH）、降鈣素（CT）胰島激素胰高血糖素胰解痙多肽胃腸道激素胃泌素、膽囊收縮素－促胰酶素（CCK-PZ）、腸泌素、腸血管活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、緩激肽、P物質(zhì)胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子多肽類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子表皮生長(zhǎng)因子（EGF），轉(zhuǎn)移因子（TF），心鈉素（ANP）等。含有多肽成分的其它生化藥物骨寧、眼生素、血活素、氨肽素、婦血寧、腦氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、助應(yīng)素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素、胎盤(pán)提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素等。多肽類(lèi)藥物分類(lèi)：蛋白質(zhì)激素

垂體蛋白質(zhì)激素生長(zhǎng)素（GH），催乳激素（PRL），促甲狀腺素（TSH），促黃體生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。

促性腺激素人絨毛膜促性腺激素（HCG），絕經(jīng)尿促性腺激素（HMG），血清性促性腺激素（SGH）。

胰島素及

其他蛋白質(zhì)激素胰島素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。血漿蛋白質(zhì)白蛋白，纖維蛋白溶酶原，血漿纖維結(jié)合蛋白（FN）,免疫丙種球蛋白，抗淋巴細(xì)胞免疫球蛋白，Veil’s病免疫球蛋白，抗－D免疫球蛋白，抗－HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纖維蛋白原，抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ。蛋白質(zhì)類(lèi)藥物分類(lèi)蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子干擾素α、β、γ（IFN）,白細(xì)胞介素1～7（IL），神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF），肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF），血小板衍生的生長(zhǎng)因子（PDGF），腫瘤壞死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，組織纖溶酶原激活因子(tPA)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，骨發(fā)生蛋白（BMP）。粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、內(nèi)在因子等。膠原蛋白明膠、阿膠等堿性蛋白質(zhì)硫酸魚(yú)精蛋白蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑凝集素PHA、ConA蛋白質(zhì)類(lèi)藥物分類(lèi)多肽化學(xué)合成概述合成原理：是一個(gè)重復(fù)添加AA的過(guò)程，一般自C端向N端合成。合成方法：（1）液相合成（2）固相合成（1963年R.B.Merrifield

創(chuàng)立，并因此獲1984年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）1953年Du.Vigneaud等合成催產(chǎn)素（oxytocin,OXT，9AA單鏈肽）1963年合成促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH，39AA單鏈肽）1965年中國(guó)科學(xué)家合成了胰島素（Insulin，51AA雙鏈肽）多肽合成的主要步驟

氨基的保護(hù)和羧基的活化羧基的保護(hù)和氨基的活化接肽和去保護(hù)基氨基保護(hù)基

芐氧羰基——強(qiáng)酸脫除叔丁氧羰基（BOC）——三氟乙酸（TFA）脫除

9-芴甲氧羰基（Fmoc）——堿脫除

多肽的固相合成(Fmoc保護(hù)法)

（1978年改進(jìn)的方法，避免了強(qiáng)酸處理）原料選擇上清破碎提取沉淀

變性復(fù)性蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)藥物－SeparationandPurification純度活性鑒定合格不合格精品

發(fā)酵

生物組織

Protein--Separation原則：富含所需蛋白質(zhì)多肽成分的，易于獲得、易于提取、無(wú)害（原核、真核發(fā)酵；生物組織）注意事項(xiàng)：種屬、發(fā)育生長(zhǎng)階段、原料的環(huán)境、解剖部位、生物狀態(tài)溶解性穩(wěn)定性合適的溶劑原料選擇提取Protein--Purification純化

根據(jù)目的蛋白與雜質(zhì)之間的差異進(jìn)行純化。1.根據(jù)蛋白質(zhì)的pI的不同進(jìn)行純化，其方法有：1）pI沉淀法

2）pI沉淀法與鹽析法相結(jié)合3）等電聚焦法

2.蛋白質(zhì)分子形狀和大小的不同進(jìn)行純化，其方法有

1）凝膠過(guò)濾

2）超濾法

3）離心法

4）透析法3.蛋白質(zhì)的溶解度不同進(jìn)行純化，其方法有：

a)鹽溶與鹽析法

b）結(jié)晶法

c）有機(jī)溶劑沉淀法4.蛋白質(zhì)電離性質(zhì)不同進(jìn)行分離：離子交換法5.蛋白質(zhì)功能專(zhuān)一性不同進(jìn)行純化：親和層析法、假親和層析法6.蛋白質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中分配不同進(jìn)行純化：萃取法7.蛋白質(zhì)的選擇性吸附的性質(zhì)進(jìn)行純化：吸附法8.蛋白質(zhì)的其他特殊性質(zhì)進(jìn)行純化分離純化方法的選擇1.分離純化的早期使用方法的選擇特點(diǎn)：提取液中的物質(zhì)十分復(fù)雜，目的蛋白濃度較稀。方法選擇原則：低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大為合適。2.各種分離純化方法的使用程序原則：相同性質(zhì)的純化方法一般不重復(fù)使用。純化方法順序先后的安排上要考慮到有利于減少工序，提高效率。3.分離純化后期的保護(hù)性措施4．對(duì)每一步驟方法的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)每一個(gè)分離純化步驟方法的好壞，除了從分辨本領(lǐng)和重現(xiàn)性二方面考慮外，還注意方法本身的回收率的高低。純化方法選擇指南豬胰島素牛胰島素賴(lài)脯人胰島素（禮來(lái)公司、速效Ins）

門(mén)冬胰島素（諾和諾德公司、速效Ins）

甘精胰島素

(安萬(wàn)特公司、長(zhǎng)效Ins)人胰島素（Insulin）B30A8;A10;B30

B28;B29B28A21;B31;B323DStructureofInsulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）目前臨床使用的胰島素來(lái)源動(dòng)物胰臟來(lái)源----經(jīng)動(dòng)物胰臟提取或適當(dāng)提純的豬、牛胰島素

半合成胰島素----以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素----重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素、速效胰島素、長(zhǎng)效胰島素1921年----從動(dòng)物胰腺中提取出胰島素，開(kāi)創(chuàng)了人類(lèi)胰島素治療的歷史。

1926年----重結(jié)晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長(zhǎng)效動(dòng)物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類(lèi)似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長(zhǎng)效人胰島素類(lèi)似物。動(dòng)物來(lái)源的胰島素（28種）藥品名稱(chēng)生產(chǎn)企業(yè)藥品名稱(chēng)生產(chǎn)企業(yè)ILETINILILLYNPHPURIFIEDPORKISOPHANEINSULINNOVONORDISKINCILETINIILILLYPROTAMINEZINC&ILETINI(BEEF-PORK)LILLYINSULINNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINIILILLYINSULININSULATARDNPHNORDISKNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINII(PORK)LILLYINSULINNORDISKMIXTARD(PORK)NOVONORDISKINCPROTAMINEZINCINSULINBRISTOLMYERSSQUIBBLENTARDNOVONORDISKINCREGULARILETINIILILLYLENTENOVONORDISKINCREGULARILETINII(PORK)LILLYLENTEILETINIILILLYREGULARPURIFIEDPORKINSULINNOVONORDISKINCLENTEILETINII(PORK)LILLYREGULARINSULINNOVONORDISKINCLENTEINSULINNOVONORDISKINCSEMILENTENOVONORDISKINCNPHILETINI(BEEF-PORK)LILLYSEMILENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHILETINIILILLYULTRALENTENOVONORDISKINCNPHILETINII(PORK)LILLYULTRALENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHINSULINNOVONORDISKINCVELOSULINNOVONORDISKINC半合成來(lái)源的胰島素（5種）藥品名稱(chēng)生產(chǎn)企業(yè)INSULATARDNPHHUMANNOVONORDISKINCMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSNOVOLIN70/30NOVONORDISKINCNOVOLINLNOVONORDISKINCNOVOLINNNOVONORDISKINC基因重組來(lái)源的胰島素（27種）藥品名稱(chēng)生產(chǎn)企業(yè)藥品名稱(chēng)生產(chǎn)企業(yè)APIDRASANOFIAVENTISUSLANTUSSANOFIAVENTISUSEXUBERAPFIZERLEVEMIRNovoNordisk

HUMALOGLILLYMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSHUMALOGMIX50/50LILLYNOVOLIN70/30NovoNordiskHUMALOGMIX75/25LILLYNOVOLINLNOVONORDISKINCHUMALOGPENLILLYNOVOLINNNOVONORDISKINCHUMULIN50/50LILLYNOVOLINRNOVONORDISKINCHUMULIN70/30LILLYNOVOLINR（Purified）NOVONORDISKINCHUMULIN70/30PENLILLYNOVOLOGNOVONORDISKINCHUMULINBRLILLYNOVOLOGMIX70/30NOVONORDISKINCHUMULINLLILLYVELOSULINBRNOVONORDISKINCHUMULINNLILLYVELOSULINBRHUMANNOVONORDISKINCHUMULINRLILLYHUMULINULILLYHUMULINRPENLILLY通化東寶

1998年12月研制出中國(guó)第一支基因重組胰島素“甘舒霖”

甘舒霖?

R--常規(guī)重組人胰島素注射液甘舒霖?

N--低精蛋白重組人胰島素注射液甘舒霖?30R--30/70混合重組人胰島素注射液（

30%常規(guī)重組人胰島素和70%低精蛋白重組人胰島素）深圳科興蘇泌啉--常規(guī)重組人胰島素注射液蘇泌啉恩--低精蛋白重組人胰島素注射液

徐州萬(wàn)邦

萬(wàn)邦林--常規(guī)重組人胰島素注射液

萬(wàn)蘇林—豬胰島素制劑胰島素國(guó)內(nèi)主要生產(chǎn)廠家其他（持有藥品注冊(cè)證）---南京新天生物化學(xué)制藥有限公司、華西醫(yī)科大學(xué)制藥廠、上海第一生化

制藥廠、武漢生化制藥廠等臨床用胰島素分類(lèi)普通胰島素：從動(dòng)物胰臟中提取人胰島素傳統(tǒng)中長(zhǎng)效胰島素

長(zhǎng)效人胰島素類(lèi)似物速效人胰島素類(lèi)似物非注射胰島素

傳統(tǒng)中長(zhǎng)效胰島素制劑

低精蛋白鋅胰島素：胰島素、魚(yú)精蛋白和鋅的結(jié)晶。

例：禮來(lái)公司，

Humulin

N(rDNA、大腸桿菌)

諾和諾德，

NovolinN(rDNA、釀酒酵母)

胰島素鋅混懸液：精蛋白鋅胰島素與常規(guī)胰島素的混懸液

例：禮來(lái)公司，Humulin30/70(30%常規(guī)胰島素，70%精蛋白鋅胰島素)

Humulin50/50

諾和諾德，

Novolin30/70

Novolin50/50缺陷：作用時(shí)間少于24小時(shí)作用峰值明顯，夜間低血糖危險(xiǎn)性高吸收不穩(wěn)定結(jié)霜現(xiàn)象，由于溫度過(guò)冷或過(guò)熱導(dǎo)致胰島素再玻璃瓶壁沉淀，喪失活性速效胰島素特點(diǎn)：起效快，皮下注射后15分鐘起效。達(dá)峰快，注射后15分鐘起效，30～60分鐘達(dá)到藥效高峰。藥效維持時(shí)間短，大約在3小時(shí)左右（2～4小時(shí)）。藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與進(jìn)餐后人體內(nèi)源性胰島素分泌十分相似，能夠很好地控制當(dāng)餐后血糖而且不容易發(fā)生低血糖。起效時(shí)間達(dá)峰時(shí)間峰持續(xù)時(shí)間作用消除時(shí)間常規(guī)皮下Ins:30-90min1.5-2.5h2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h

B26-30對(duì)于胰島素結(jié)合于胰島素受體的功能無(wú)關(guān)，但是對(duì)胰島素形成二聚體有關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。因此對(duì)此區(qū)段進(jìn)行修飾將產(chǎn)生一些自聚合能力下降但是與胰島素受體結(jié)合能力不變的新型速效胰島素類(lèi)似物。研制機(jī)理已上市藥物：

Lispro

、

Aspart、Apidra

Lispro

（賴(lài)脯胰島素，Humalog?）是第一個(gè)用于臨床的速效胰島素類(lèi)似物,由美國(guó)禮來(lái)公司研制生產(chǎn)，將人胰島素的B28與B29位的氨基酸對(duì)換。。

Aspart（門(mén)冬胰島素，Novolog?）由丹麥諾和諾德公司研制生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)與人胰島素的區(qū)別在于用天冬氨酸取代了B鏈28位上的脯氨酸。APIDRA（賴(lài)谷胰島素，Apidra?）安萬(wàn)特公司研制，以賴(lài)氨酸和谷氨酸分別取代了人胰島素B3位的天冬氨酸和B29位的賴(lài)氨酸。長(zhǎng)效胰島素-人胰島素類(lèi)似物1.

甘精胰島素（glargine）：商品名Lantus?------甘氨酸替代胰島素A鏈21位門(mén)冬氨酸、并在B鏈末端增加兩個(gè)精氨酸。

●使胰島素結(jié)合更多帶正電的氨基酸殘基，改變等電點(diǎn)，使等電點(diǎn)由5.4上升至中性。這樣，胰島素類(lèi)似物在酸性條件下可溶，在生理的近中性條件下結(jié)晶。2.InsulinDetemir：商品名Levemir?

------胰島素B鏈29位賴(lài)氨酸側(cè)鏈通過(guò)酰基化連接一個(gè)N-16-烷基酸的14碳游離脂肪酸●該游離脂肪酸能與白蛋白結(jié)合，延緩與胰島素受