第二章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)

第二章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)第二章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究天然蛋白質(zhì)剪接全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的為蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)性信息探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理簡單蛋白質(zhì)構(gòu)建或骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋白質(zhì)相互作用的類型及本質(zhì)的很好途徑，為解決蛋白質(zhì)折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)存在問題設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)相比缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性極明顯的功能優(yōu)越性。設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)有正確的形貌、顯著的二級結(jié)構(gòu)及合理的熱力學(xué)穩(wěn)定性，但三級結(jié)構(gòu)的確定性較差。按照改造部位的多寡分為三類：第一類為“小改”，可通過定位突變或化學(xué)修飾來實(shí)現(xiàn)；第二類為“中改”，對來源于不同蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝；第三類為“大改”，即完全從頭設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)可分為兩個(gè)層次在已知立體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上所進(jìn)行的直接將立體結(jié)構(gòu)信息與蛋白質(zhì)的功能相關(guān)聯(lián)的高層次的設(shè)計(jì)工作在未知立體結(jié)構(gòu)的情形下借助于一級結(jié)構(gòu)的序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)所進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)工作。蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)流程圖蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大致涉及的幾個(gè)重要方面蛋白質(zhì)來源：真菌、細(xì)菌、動(dòng)物蛋白質(zhì)和植物蛋白質(zhì)篩選以及純化蛋白質(zhì)需要測定它們的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等一、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的判斷目前PDB(ProteinDataBank)已收集數(shù)以萬計(jì)個(gè)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，但是通常蛋白質(zhì)序列的數(shù)目比蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目大100倍。1、對于已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)：根據(jù)PDB中三維結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)進(jìn)行設(shè)計(jì)2、對于未知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)：如果PDB中沒有收錄又未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們需要通過蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)及NMR方法測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者通過結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)中占有重要位臵。建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點(diǎn)或區(qū)域以及預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的。專一性突變產(chǎn)物是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成敗的關(guān)鍵。一些新技術(shù)，如PCR及自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展使各種類型的基因工程變得快速、容易。二、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理①內(nèi)核假設(shè)。所謂內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進(jìn)化中保守的內(nèi)部區(qū)域。在大多數(shù)情況，內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元組成②所有蛋白質(zhì)內(nèi)部都是緊密堆積(很少有空穴大到可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體)，并且沒有重疊。③所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的(主鏈及側(cè)鏈)④疏水及親水基團(tuán)需要合理地分布在溶劑可及表面及不可及表面。⑤在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何，符合正確的鍵長、鍵角及整體的幾何。⑥對于金屬蛋白，大部分配基含有多于一個(gè)與金屬作用或形成氫鍵的基團(tuán)。其余形成圍繞金屬中心的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這涉及與蛋白質(zhì)主鏈、側(cè)鏈或水分子的相互作用。⑦最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列。⑧結(jié)構(gòu)及功能的專一性。形成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，獨(dú)特的分子間相互作用是生物相互作用及反應(yīng)的標(biāo)志。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)步驟1）以蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的氨基酸2）利用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3）預(yù)測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或功能-穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算預(yù)測新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)注意的問題A應(yīng)確定蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域，包括帶有特殊扭角的氨基酸、鹽橋、密堆積區(qū)等。B應(yīng)確定對功能非常重要的位臵。C考察剩余位臵對所希望改變的影響。D當(dāng)進(jìn)行互換或插入/刪除殘基是應(yīng)考慮他們對結(jié)構(gòu)特征的影響，如疏水堆積、側(cè)鏈取向、氫鍵、鹽橋等。三、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系研究定位突變在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中的作用。突變蛋白質(zhì)構(gòu)象的探測定位突變種類插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基最大量的定位突變是在體外利用重組DNA技術(shù)或PCR方法突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的評估溶解性熱力學(xué)分析Ｘ射線晶體學(xué)及ＮＭＲ譜園二色散方法單克隆抗體探測構(gòu)象變化結(jié)構(gòu)與功能的容忍度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對殘基的替換有一定的容忍度，即結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有一定的穩(wěn)健度。Fersht等替換了Barnase的所有內(nèi)核殘基。結(jié)果表明23％的突變體保留了酶的活性Mathews及其合作者在溶菌酶內(nèi)核中替換多至10個(gè)殘基。實(shí)驗(yàn)證明多重取代的蛋白仍具有活性以及協(xié)同折疊這些結(jié)果說明不同的氨基序列具有相近的設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)。第二節(jié)全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)特征：全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是另一類蛋白質(zhì)工程，合成具有特異結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。根據(jù)所希望的結(jié)構(gòu)及功能設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)功能的從頭設(shè)計(jì)取得的進(jìn)展：血紅素結(jié)合蛋白、氧化還原活性蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合蛋白、基于蛋白質(zhì)的高分子材料一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)中心問題：設(shè)計(jì)一個(gè)具有穩(wěn)定及獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)的序列１．二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝：２．配體誘導(dǎo)組裝３．通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝自然界唯一用于交叉連接的方法是二硫鍵。４．在合成模板上肽的組裝在模板上組裝合成蛋白的方法特點(diǎn)：使用人工合成的模板代替天然蛋白中的連接二級結(jié)構(gòu)的單元模板：寡肽，可形成兩個(gè)反平行β折疊鏈，設(shè)計(jì)一個(gè)Pro-Gly的轉(zhuǎn)折。在鏈的兩端設(shè)計(jì)一個(gè)二硫鍵，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。５．線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)不用模板或交叉連接而通過線性多肽折疊成球形的確定的三維結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)追求的目標(biāo)之一主要障礙：構(gòu)象熵實(shí)例:α-螺旋根據(jù)α-螺旋的兩親性。形成的α-螺旋顯著穩(wěn)定性是因?yàn)樾纬擅黠@的疏水核，還有Glu和Lys形成的鹽橋，螺旋偶極的電荷中和，增加了在螺旋/轉(zhuǎn)折連接處的柔性二、蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)又具有有趣和有用的功能。功能設(shè)計(jì)主要涉及鍵合及催化為達(dá)到這些目的可以采