常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光 PCR 方法

GB/TXXXXX—XXXX

常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了常見畜禽動(dòng)物源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品、飼料、動(dòng)物組織、動(dòng)物產(chǎn)品及制品中常見畜禽（水牛、黃牛、牦牛、綿羊、

山羊、豬、駱駝、馬鹿、梅花鹿、馴鹿、兔、狗、雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、火雞）及其他可能摻假品

種（貓、狐貍、水貂、貉、鼠）物種成分的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)，最低檢出限（LOD）

達(dá)1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

實(shí)時(shí)熒光PCRrealtimePCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程。

3.2

Ct值cyclethreshold

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4原理

利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，根據(jù)不同物種的特異性基因序列對(duì)常見畜禽動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒定。以

提取的DNA為模板進(jìn)行內(nèi)參照基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，以確定樣品DNA的提取質(zhì)量；通過(guò)物種特

異性引物及探針進(jìn)行畜禽動(dòng)物源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒

光信號(hào)的強(qiáng)弱判定，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見畜禽動(dòng)物源性成分的定性檢測(cè)。

5檢測(cè)用引物和探針

內(nèi)參照引物探針序列和常見畜禽動(dòng)物特異性引物探針序列見表1。探針5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'

端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

表1引物探針序列

2

GB/TXXXXX—XXXX

靶標(biāo)物種序列基因來(lái)源

內(nèi)參照F：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA18SrRNA基因

R：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT

P：CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC

黃牛F：GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGGNADHdehydrogenase

R：GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAGsubunit5(ND5)基因

P：ACAAATCTCAATACCTGAGACCTCCAACAGA

牦牛F：GACTAATATTCGAAAATCCCytb基因

R：CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCAC

P：CAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCAT

水牛F：TTCATTGAYCTCCCTGCTCCATPase8基因

R：GGAATAGGCCGGTGAGGATT

P：ACTTTGGCTCTCTCC

駱駝F：ATTCTTTGCCTTCCACTTCACytb基因

R：AGCGTATGCGAATAGGAAAT

P：CCTACACGAAACAGGCTCTAATAACCCGAC

梅花鹿F：CCTACCACCGAAGCAATAGTGGCOI基因

R：GGTGCACTCTCAATAACTTCTGAGA

P：CACTGTAGCTACTCAAGAAGC

馬鹿F：TAGTTATGTAAACAAGACTG12SrRNA基因

R：ATAGACTGTAGTAGCAAGGAA

P：AGGACTTGGCGGTGCTTTAT

馴鹿F：CTCCCAGTACGAAAGGACCA16SrRNA基因

R：GGGCGGGATATGTTTGTGTA

P：CCAACTTTAATCAAGCGCCT

山羊F：TGGAGTAATCCTCCTGCTCCytb基因

R：GGATTGCTGAAAGAAGATTA

P：CATAGGCTATGTTTTACCATGAG

綿羊F：ACACAACTTCTACCACAACCCCytb基因

R：AAACAATGAGGGTAACGAGGG

P：ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA

鴿F：GAGCAACCCCTCAACGTACT16SrRNA基因

R：ACCTCCTCGTCGATATGGACTC

P：CCCCTCAACGTACTAACAGTAACCAGAC

鴨F：GGCCACACAAATCCTCACAGCytb基因

R：TGTGTTGGCTACTGAGGAGAAA

P：CCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGAC

鵝F：CCACCGCGAATCCTCAATmtDNA基因

R：TCTTGTTTTTGGAGGATTTGTTCTC

P：CCATCGCAGAGCCTGGTCGATATTTTT

鵪鶉F：GGATCACTTTGCCCACTTTAA12SrRNA基因

3

GB/TXXXXX—XXXX

R：GGGTGACGGGCGGTATG

P：ATGGCCCTGAGGCAC

水貂F：GCTTCAATCCTCTATTTCATAACytb基因

R：GCTTCTTCCTTGAGTCTTA

P：CCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT

貓F(tuán)：CTGCTGTCTTACTACTTCTACOI基因

R：GGTGTTTAGGTTTCGATC

P：CACTTCCAGTCTTAGCAGCGG

兔F：TAATCGTCACCGCACATGCCCOI基因

R：CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA

P：ACAAGCCAGTTCCCGAAGCCTCCA

豬F：ATCTACATGATTCATTACAATTACatp8基因

R：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA

P：ATCTCAAACTACTCATACCCA

狗F：TCCAGGTAAACCCTTCTTCCCD-loop基因

R：TTACGAGCAAGGGTTGATGGT

P：GCATTAATGGTTTGCCCCATGCATATAAGC

狐貍F：TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTTCOI基因

R：GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG

P：CCCTGCACCTGGCCGGAGTC

貉F：AATCTTGCCTGGGTTTGGAACOI基因

R：CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA

P：CATACTACTCCGGGAAAA

雞F：CCCTCCTCCTTTCATCCTCATNADHdehydrogenase

R：GTCATAGCGGAACCGTGGATAsubunit1(ND1)基因

P：CTATGAATCCGGGCCTC

火雞F：GCCCTAACCCCTTAAGAAAAGAAT12SrRNA基因

R：AGTTGCTATGGCTAAGTCAAGTTTACAC

P：CTTGCTTGAGCCACACC

鼠F：ATTCCGCCCAATCACCCAAACytb基因

R：TTGGCCTCCGATTCATGTTAAGA

P：TACTGAATYCTAGTAGCCAACCT

注：F代表上游引物；R代表下游引物；P代表探針

6試劑

三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉等。

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。

7配置溶液

7.1主要試劑

4

GB/TXXXXX—XXXX

CTAB提取緩沖液：20g/LCTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），1.4mol/L

NaCl，0.1mol/LTris（trishydroxymethylaminomethane，三羥甲基氨基甲烷），0.02mol/LNa2EDTA

（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，乙二胺四乙酸二鈉），調(diào)節(jié)pH至8.0；CTAB沉淀液：

5g/LCTAB，40mmol/LNaCl；70%乙醇(V/V)；NaCl溶液(1.2mol/L)；蛋白酶K溶液（10mg/mL）。

7.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液

12.5μL反應(yīng)體系包括：1U～2U（Unit，酶學(xué)單位)的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L～4.0mmol/L

的Mg2+、0.2U～1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A，C，G)TPs、0.2mmol/L～0.4mmol/LdUTP、400

nmol/LROX染料(某些熒光PCR儀不需要ROX校正)。

8儀器設(shè)備

8.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

8.2核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。

8.3恒溫水浴鍋。

8.4離心機(jī)：離心力≥12000g。

8.5pH計(jì)。

8.6烘箱。

8.7天平：感量0.01g。

9檢驗(yàn)步驟

9.1樣品處理方法

將食品、飼料、動(dòng)物組織、動(dòng)物制品等待檢樣品研磨均勻，分裝三份，其中一份為檢樣，另外

兩份為留存樣品。

9.2DNA提取

稱取100mg樣品至一潔凈2.0mL離心管中，加入1000μLCTAB提取緩沖液和10μL蛋白酶K溶

液，置于65℃裂解1h，期間混勻幾次；取出后12000g離心10min，取上清液至一潔凈2.0mL離心

管中；加入0.7倍體積的三氯甲烷，振蕩混勻30s，12000g離心10min；取上清液600μL至一潔凈

2.0mL離心管中，加入2倍體積CTAB沉淀液，振蕩混勻30s，室溫靜置1h，12000g離心10min；

棄上清液，加入350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀后加入350μL三氯甲烷，振蕩混勻30s；

12000g離心10min，取上清液；加入0.8倍體積的異丙醇或2倍體積-20℃冰箱中預(yù)冷的無(wú)水乙醇混勻，

-20℃放置1h，12000g離心15min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000g離心10min，棄上

清，室溫下晾干；加入100μL雙蒸水，溶解沉淀，-20℃保存。

也可用等效DNA提取試劑盒提取模板DNA。

DNA提取過(guò)程中以水代替樣品設(shè)置提取空白對(duì)照，并置于每個(gè)提取系列中的最后。

9.3DNA濃度和純度的測(cè)定

使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA

的濃度按照式（1）計(jì)算，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，取平均值。通過(guò)OD260/OD280比值判斷提取DNA的

純度。若DNA的OD260/OD280值在1.7～2.1，濃度在5～100ng/μL，適宜實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。

5

GB/TXXXXX—XXXX

C=A×N×50/1000??????????????????????????（1）

C——DNA濃度，單位為微克每微升（μg/μL）；

A——260nm處的吸光值；

N——核酸稀釋倍數(shù)。

9.4實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以目標(biāo)物種提取的的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以

已知不含目標(biāo)物種成分的樣品提取的DNA為陰性對(duì)照，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。樣品、內(nèi)參照和對(duì)照設(shè)

置兩個(gè)平行的反應(yīng)體系，以Ct平均值作為最終結(jié)果。反應(yīng)體系的體積為25μL，體系組成見表2，反應(yīng)參

數(shù)見表3。

表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系組成

試劑名稱貯備液濃度加入PCR反應(yīng)體系的體積/μL

反應(yīng)混合液—12.5

5'端引物10μmol/L1

3'端引物10μmol/L1

探針10μmol/L1

DNA模板5～100ng/μL5

無(wú)菌水—補(bǔ)足至總體積為25

表3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)

待測(cè)物反應(yīng)參數(shù)

內(nèi)參照95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

黃牛95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

牦牛95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

水牛95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

駱駝95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

梅花鹿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

馬鹿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

馴鹿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

山羊95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

綿羊95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

豬95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

狗95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

鴿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

火雞95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

鼠95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)

狐貍95℃5min；95℃15s，60℃40s，40個(gè)循環(huán)

貉95℃5min；95℃15s，60℃40s，40個(gè)循環(huán)

雞95℃5min；95℃15s，60℃40s，40個(gè)循環(huán)

鴨95℃2min；95℃15s，65℃80s，40個(gè)循環(huán)

鵝95℃2min；95℃15s，65℃80s，40個(gè)循環(huán)

6

GB/TXXXXX—XXXX

鵪鶉95℃2min；95℃15s，65℃80s，40個(gè)循環(huán)

兔95℃10s；95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)

水貂95℃10s；95℃5s，52℃10s，72℃34s，40個(gè)循環(huán)

貓95℃10s；95℃5s,，52℃10s，72℃34s，40個(gè)循環(huán)

注：反應(yīng)參數(shù)可以適當(dāng)調(diào)整

10質(zhì)量控制

以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效；

a）空白對(duì)照：熒光通道無(wú)熒光信號(hào)檢出，Ct值應(yīng)≥40.0；

b）陰性對(duì)照：熒光通道無(wú)熒光信號(hào)檢出，Ct值應(yīng)≥40.0；

c）陽(yáng)性對(duì)照：熒光通道有熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值≤35.0；

d）內(nèi)參對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值<30.0。

11結(jié)果判定及表述

11.1結(jié)果判定

在符合第10章的情況下，被檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：

a）如Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品陽(yáng)性，擴(kuò)增靶標(biāo)序列參見附錄A；

b）如Ct值≥40.0，則判定為被檢樣品陰性；

c）如35.0<Ct值<40.0，則重復(fù)一次。如再次擴(kuò)增后Ct值仍為<40.0，則判定被檢樣品陰性；

如再次擴(kuò)增后Ct≥40.0，則判定被檢樣品陰性。

11.2結(jié)果表述

11.2.1結(jié)果為陽(yáng)性者，表述為“檢出目標(biāo)物種成分”。

11.2.2結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出目標(biāo)物種成分”。

12檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施

按照GB/T27403中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。

7

GB/TXXXXX—XXXX

附錄A

（資料性附錄）

黃牛成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:MF169209.1）

ggtttcattttagcaatagcatggttcctaacaaatctcaatacctgagacctccaacagatcttcatactaaacccaagcgactcaaacatacccttgattggac

牦牛成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:GQ464309.1）

gactaatattcgaaaatcccatccactaataaaaattgtaaacaacgcattcattgaccttccagctccatcaaacatttcatcatggtgaaacttcggctccctcctag

gag

水牛成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:MH880269.1）

ttcattgatctccctgctccatcaaacatctcatcatgatgaaactttggctctctcctaggcatctgcctaattctgcaaatcctcaccggcctattcc

駱駝成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:MH110007.1）

attctttgccttccacttcatcctgccatttattatcacggccctagtagccgtacacctattattcctacacgaaacaggctctaataacccgacaggaatctcctcag

acatagacaaaatcccattccacccctactacacaattaaagacatcctaggagcactgctactaatattaattctccttattctcgtactgttctcaccagacttattag

gagatcctgacaactatactcccgctaaccccctcaatacaccaccacacattaagccggaatgatatttcctattcgcatacgct

梅花鹿成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:D14379.2）

cctaccaccgaagcaatagtggacactgtagctactcaagaagctttctcagaagttattgagagtgcacc

馬鹿成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:NC_039923.1）

tagttatgtaaacaagactgttcgccagagtactaccggcaatagcttaaaactcaaaggacttggcggtgctttatacccttctagaggagcctgttctataatcgat

aaaccccgataaacctcaccattccttgctactacagtctat

馴鹿成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:GU220719.1）

ctcccagtacgaaaggaccagagaaataaggccaactttaatcaagcgccttaaattaactaatgatttcatcttaattagatacacaaacatatcccgccc

山羊成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:LS992662.1）

tggagtaatcctcctgctcgcgacaatggccacagcattcataggctatgttttaccatgaggacaaatatcattttgaggggcaacagtcatcactaatcttctttca

gcaatcc

綿羊成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:KY786037.1）

Acacaacttctaccacaacccagaattaataacaacaaaaacaccgaaacaaaatactccttgagaaacaaaatgaacgaaaatctatttgcctctttcattacccc

tataatatttggtctccccctcgttaccctcattgttt

鴿成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:GQ240309.1）

gagcaacccctcaacgtactaacagtaaccagacccaatataattgaccaatggaccaagctaccccagggataacagcgcaatctcctccaagagtccatatc

gacgaggagg

鴨成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列(GenBank:EU914150.1)

ggccacacaaatcctcacaggcctcctactggctatgcactacaccgcagacacatcccttgctttctcctcagtagccaacaca

8

GB/TXXXXX—XXXX

鵝成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:AF363031）

ccaccgcgaatcctcaatcaaccccactggggccactaccatcgcagagcctggtcgatatttttcggttggggcgaccttggaggagaacaaatcctccaaaa

acaaga

鵪鶉成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:AM902516）

ggatcactttgcccactttaagatggccctgaggcacgtacataccgcccgtcaccc

水貂成分基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:HM106322.1）

gcttcaatcctctatttcataatcctcctagtcttcatgccaatcgtcagyattattgaaaataatctattaaaatgaagagtctttgtagtatatcaattacyttggtcttgt

aaaccaaaaatggagaaccctatctccctaagactcaaggaagaagc

貓成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:U20753.1）

ctgctgtcttactacttctatcacttccagtcttagcagcgggaatcactatattattaacagatcgaaacctaaacacc

兔成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:NC_001913.1COX1）

taatcgtcaccgcacatgcctttgtaataatcttctttatagtcatgcctattataattggaggcttcgggaactggcttgtccccctgataattggggctcctgacatag

豬成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列(Genbank:KY964306.1)

Atctacatgattcattacaattacatcaataattataacattatttattttattccaactaaaaatctcaaactactcatacccagcaagcccagaat

caaccgaactcaaaactcaaaaacatag

狗成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列(Genbank:KY700649.1)

tccaggtaaacccttcttccctcccctatgtacgtcgtgcattaatggtttgccccatgcatataagcatgtacataatattatattcttacatagga

catatcaactcaatctcacaattcattgatctgtcagcagtatcaaatgcatatcacttagtccaataagggcttaatcaccatgcctcgagaaac

catcaacccttgctcgtaa

狐貍成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:JF443559.1）

tggagcatcagtagaccttacaattttctccctgcacctggccggagtctcttcaattttaggagctattaatttcatcactactattatcaatataaaacctcccgcc

貉成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:AF028197.1）

aatcttgcctgggtttggaataatttcccatatcgttacatactactccgggaaaaaagaaccttttggttacataggaatagtctgagcaataatatctattggattctta

ggctttatcgtgtgagcccaccacatatttactg

鼠成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:KY611388.1）

attccgcccaatcacccaaaccctatactgaattctagtagccaacctcttcattttaacatgaatcggaggccaa

雞成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（Genbank:KY039437）

9

GB/TXXXXX—XXXX

ccccttaatgacatgccccaattaaacccaaacccatgattctccatcatactcctaacttgattcaccttctctctgcttatccaacccaaacttctttcattcactctaa

caaacaaccctgcaaacaaaattacaacaactaaacccacccc

火雞成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列（GenBank:U83741.1）

gccctaaccccttaagaaaagaataaaggagcaggtatcaggcacactctaatgtagcccaagacgccttgcttgagccacacccccacgggtattcag

cagtaattaaccttaagcaataagtgtaaacttgacttagccatagcaact

_________________________________

10

ICS07.080

A40

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX

常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR方法

Identificationofanimalingredientfromcommonlivestockandpoultry

Real-timePCR

點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

GB/TXXXXX—XXXX

常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了常見畜禽動(dòng)物源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品、飼料、動(dòng)物組織、動(dòng)物產(chǎn)品及制品中常見畜禽（水牛、黃牛、牦牛、綿羊、

山羊、豬、駱駝、馬鹿、梅花鹿、馴鹿、兔、狗、雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、火雞）及其他可能摻假品

種（貓、狐貍、水貂、貉、鼠）物種成分的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)，最低檢出限（LOD）

達(dá)1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

實(shí)時(shí)熒光PCRrealtimePCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程。

3.2

Ct值cyclethreshold

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4原理

利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，根據(jù)不同物種的特異性基因序列對(duì)常見畜禽動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒定。以

提取的DNA為模板進(jìn)行內(nèi)參照基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，以確定樣品DNA的提取質(zhì)量；通過(guò)物種特

異性引物及探針進(jìn)行畜禽動(dòng)物源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒

光信號(hào)的強(qiáng)弱判定，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見畜禽動(dòng)物源性成分的定性檢測(cè)。

5檢測(cè)用引物和探針

內(nèi)參照引物探針序列和常見畜禽動(dòng)物特異性引物探針序列見表1。探針5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'

端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

表1引物探針序列

2

GB/TXXXXX—XXXX

靶標(biāo)物種序列基因來(lái)源

內(nèi)參照F：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA18SrRNA基因

R：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT

P：CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC

黃牛F：GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGGNADHdehydrogenase

R：GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAGsubunit5(ND5)基因

P：ACAAATCTCAATACCTGAGACCTCCAACAGA

牦牛F：GACTA