第六章 免疫學(xué)檢測技術(shù)課件

06第六章免疫學(xué)技術(shù)第六章免疫學(xué)檢測技術(shù)06第六章免疫學(xué)技術(shù)第一節(jié)、抗體的制備一、抗血清的制備（一）用于免疫的動物、主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，一般制備免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清。06第六章免疫學(xué)技術(shù)用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，雄性，注意飼養(yǎng)，消除動物的個體差異，及免疫過程中死亡的影響。家兔中純種新西蘭兔最好，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（二）免疫途徑多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（三）佐劑注射抗原時加入的一類能增強抗原的抗原性、刺激機體產(chǎn)生較強免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為免疫佐劑。06第六章免疫學(xué)技術(shù)佐劑的作用：延長抗原體內(nèi)存留時間增加抗原刺激作用刺激免疫活性細胞增多促進T細胞與B細胞互作。06第六章免疫學(xué)技術(shù)不完全福氏佐劑：羊毛脂：石臘油=1：5，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），福氏完全佐劑：在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗。06第六章免疫學(xué)技術(shù)配制方法：按比例將羊毛脂與石臘油置容器內(nèi)，用超聲波混勻，高壓滅菌，置4℃下保存。免疫前取等容積佐劑與免疫原溶液混合，振蕩器混勻成乳狀，也可研磨均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液，加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，至滴于冰水上5～10min內(nèi)完全不擴散為止。06第六章免疫學(xué)技術(shù)為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即完全乳化。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（四）免疫方法抗原劑量：首次劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為首次的1/4左右。每2～3周加強免疫一次。加強免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強免疫時不用。06第六章免疫學(xué)技術(shù)第2次加強免疫后2周，耳緣靜脈取血2～3mL，制血清，測抗體效價。如未達到預(yù)期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止。抗體效價達到預(yù)期水平時，即可放血制抗血清。06第六章免疫學(xué)技術(shù)圖2-3抗體反應(yīng)06第六章免疫學(xué)技術(shù)（五）抗血清的采集與保存耳緣靜脈或耳動脈放血頸動脈入血心臟采血06第六章免疫學(xué)技術(shù)耳緣靜脈或耳動脈放血：將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴張、充血。06第六章免疫學(xué)技術(shù)用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。06第六章免疫學(xué)技術(shù)頸動脈放血：將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。06第六章免疫學(xué)技術(shù)血清析出：收集的血液室溫下1h左右凝固，然后置4℃過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2mL），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后于4℃冰箱保存。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（六）抗血清質(zhì)量的評價不同的動物，同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化。必須經(jīng)常采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。06第六章免疫學(xué)技術(shù)

1．抗血清的效價：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。

06第六章免疫學(xué)技術(shù)（1）放射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)放射性標記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀釋度為效價。結(jié)合率：放射強度的檢測的變化如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000。06第六章免疫學(xué)技術(shù)1：100001：150001：50001：10001：200001：30000血清稀釋度抗原結(jié)合率100%100%80%50%30%20%06第六章免疫學(xué)技術(shù)影響抗血清的效價測定的因素抗血清本身的性質(zhì)受標記抗原的質(zhì)量孵育時間所用稀釋液的成分pH06第六章免疫學(xué)技術(shù)（2）雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

06第六章免疫學(xué)技術(shù)球脂板的制備：100mlpH7.1的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。06第六章免疫學(xué)技術(shù)06第六章免疫學(xué)技術(shù)中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。06第六章免疫學(xué)技術(shù)2．特異性測定

特異性：抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性是以交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。06第六章免疫學(xué)技術(shù)交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率，求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。

S=y/Z×100%

S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。

06第六章免疫學(xué)技術(shù)如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。06第六章免疫學(xué)技術(shù)3．親合力

抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。影響親合力的因素：抗原分子的大小抗體分子的結(jié)合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度。06第六章免疫學(xué)技術(shù)親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在10～10L/mol之間，也有高達10L/mol的。計算親合常數(shù)的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。8121406第六章免疫學(xué)技術(shù)(七）免疫失敗的原因及措施1、動物的種屬及品系是否合適？可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量。2、抗原質(zhì)量是否良好？可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進提取方法。3、制備的免疫原是否符合要求？可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進。06第六章免疫學(xué)技術(shù)4、佐劑：乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。5、免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間、次數(shù)，免疫的途徑是否合適？6、動物的飼養(yǎng)：如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。06第六章免疫學(xué)技術(shù)二、單克隆抗體的制備（一）動物的選擇與免疫1．動物：純種BALB/C小鼠較溫順。離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。06第六章免疫學(xué)技術(shù)2．免疫方案：至關(guān)重要（1）可溶性抗原免疫：一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。06第六章免疫學(xué)技術(shù)初次免疫：抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）↓3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價）↓3周后加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）↓2-3周后取脾融合↓3天后06第六章免疫學(xué)技術(shù)（2）顆粒抗原免疫：不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×10個細胞。7初次免疫1×10/0.5mlip↓2～3周后第二次免疫1×10/0.5mlip↓3周后加強免疫（融合前三天）1×10/0.5mlip或iv↓取脾融合77706第六章免疫學(xué)技術(shù)（二）細胞融合1．細胞融合前準備（1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞系見表。06第六章免疫學(xué)技術(shù)常用于融合試驗的骨髓瘤細胞系06第六章免疫學(xué)技術(shù)骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以10～5×10/mL為宜，最大濃度不得超過10/mL細胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。45606第六章免疫學(xué)技術(shù)（2）飼養(yǎng)細胞：組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易繁殖，加入其它活細胞后可促進這些細胞的繁殖，所加入的這種細胞稱為飼養(yǎng)細胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞如：小鼠腹腔巨噬細胞，小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2×10或10細胞/孔。4506第六章免疫學(xué)技術(shù)2．細胞融合的步驟

（1）制備飼養(yǎng)細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周齡↓拉頸處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min↓用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜↓用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴禁刺破腸管）↓反復(fù)沖洗，吸出沖洗液↓沖洗液放入10ml離心管，1200rpm，離心，5～6min↓用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)至1×10/ml↓加入96孔板，100μL/孔↓放入37℃CO2孵箱培養(yǎng)5

06第六章免疫學(xué)技術(shù)（2）制備免疫脾細胞

最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死↓無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次↓脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)↓離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次↓計數(shù)↓取10脾淋巴細胞懸液備用806第六章免疫學(xué)技術(shù)（3）制備骨髓瘤細胞取對數(shù)生長骨髓瘤細胞離心↓用無血清培養(yǎng)液洗2次↓計數(shù)，取得×10細胞備用706第六章免疫學(xué)技術(shù)（4）融合①、將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5混合，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。②、90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。③、加37℃預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。06第六章免疫學(xué)技術(shù)④、離心，800rpm,6min。⑤、棄上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。⑥、將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。⑦、將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測1．HAT選擇雜交瘤細胞脾細胞和骨髓瘤細胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。

06第六章免疫學(xué)技術(shù)用HAT選擇培養(yǎng)3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落。HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。06第六章免疫學(xué)技術(shù)2．抗體的檢測（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它：如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（四）雜交瘤的克隆化雜交瘤克隆化：將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關(guān)抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化。06第六章免疫學(xué)技術(shù)克隆化的原則：對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制。因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。06第六章免疫學(xué)技術(shù)克隆化的方法

有限稀釋法克?。?）克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。（2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。（3）調(diào)整細胞為3～10個細胞/ml。（4）取頭天準備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100μL。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。（6）8～9天可見細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。（8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。06第六章免疫學(xué)技術(shù)軟瓊脂培養(yǎng)法克隆（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。（4）1ml0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。（6）4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔中進行培養(yǎng)。（7）檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（五）雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇1．雜交瘤細胞的凍存未凍存細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。06第六章免疫學(xué)技術(shù)凍存方法：細胞應(yīng)在每支安瓿含1×10以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。606第六章免疫學(xué)技術(shù)凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中，保存數(shù)年或更長時間凍存細胞要定期復(fù)蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。06第六章免疫學(xué)技術(shù)2．細胞復(fù)蘇將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)兩種方式：（1）體外大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。06第六章免疫學(xué)技術(shù)（2）體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

①實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×10/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml，共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

706第六章免疫學(xué)技術(shù)②腹水的制備：先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×10個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10mL腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/mL，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。606第六章免疫學(xué)技術(shù)（七）單克隆抗體的鑒定1．抗體特異性的鑒定

除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。06第六章免疫學(xué)技術(shù)2．McAb的Ig類與亞類的鑒定一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。06第六章免疫學(xué)技術(shù)3．McAb中和活性的鑒定用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。06第六章免疫學(xué)技術(shù)4．McAb識別抗原表位的鑒定用競爭結(jié)合試驗，測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。06第六章免疫學(xué)技術(shù)5．McAb親合力的鑒定用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。06第六章免疫學(xué)技術(shù)一、酶聯(lián)免疫吸附測定法第二節(jié)免疫學(xué)檢測技術(shù)1、基本原理采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。3種必要的試劑：①、固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②、酶標記的抗原或抗體（標記物）③、酶作用的底物（顯色劑）06第六章免疫學(xué)技術(shù)２、基本步驟抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，加酶的底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。06第六章免疫學(xué)技術(shù)其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。ELISA的優(yōu)點：簡單，方便訊速，特異性強。06第六章免疫學(xué)技術(shù)間接ELISA法抗原結(jié)合于小孔內(nèi)加入特異性抗體加入酶標記的第二抗體加入酶的底物顯色洗滌洗滌洗滌加入酶的底物顯色洗滌洗滌洗滌加入樣品，無抗原加入特異性抗體加入酶標記的第二抗體SSS06第六章免疫學(xué)技術(shù)洗滌洗滌洗滌抗體結(jié)合于小孔內(nèi)加入樣品，樣品中無抗原加入酶標記的第二抗