化學(xué)品 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)方法 征求意見(jiàn)稿

4GB/T21786—XXXX化學(xué)品體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)方法本文件規(guī)定了化學(xué)品體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)的范圍、術(shù)語(yǔ)和定義、試驗(yàn)基本原則、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告。本文件適用于檢測(cè)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變規(guī)范性引用文件。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)下列定義和術(shù)語(yǔ)適用于本文件。3.1突變mutagenic在基因或染色體結(jié)構(gòu)上的DNA堿基配對(duì)序列上發(fā)生遺傳改變。3.2正向突變forwardmutation從原型（野生型）轉(zhuǎn)變至突變型的基因突變，可引起酶活性和編碼蛋白的改變和丟失。3.3堿基對(duì)置換突變劑basepairsubstitutionmutagens能夠引起DNA中一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)置換的物質(zhì)。3.4移碼突變劑frameshiftmutagens能夠引起DNA分子中單個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)增加或缺失的物質(zhì)。3.5表型表達(dá)時(shí)間phenotypicexpressiontime新的突變細(xì)胞耗盡未改變的基因產(chǎn)物所需的時(shí)間。3.6突變頻率mutantfrequency所觀察到的突變細(xì)胞數(shù)與存活細(xì)胞數(shù)之比值。5GB/T21786—XXXX3.7相對(duì)總生長(zhǎng)數(shù)relativetotalgrowth與陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)相比，整個(gè)過(guò)程中所增加的細(xì)胞數(shù)，等于懸浮生長(zhǎng)數(shù)乘以相對(duì)集落形成效率之積。3.8相對(duì)懸浮生長(zhǎng)relativesuspensiongrowth與陰性對(duì)照組相比，整個(gè)表達(dá)期細(xì)胞增加的數(shù)量3.9細(xì)胞活性viability表達(dá)期結(jié)束后，接種在選擇性培養(yǎng)基中細(xì)胞形成集落的效力。3.10細(xì)胞存活率survival處理結(jié)束后，接種的處理細(xì)胞形成集落的效力，通常以與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)的存活率比值表示。3.11克隆效率cloningefficiency細(xì)胞在低密度下生長(zhǎng)，最后生成可以計(jì)數(shù)的集落的細(xì)胞的百分比。3.12有絲分裂重組mitoticrecombination在有絲分裂過(guò)程中，同源染色單體之間的重組可能導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂或雜合性的喪失。3.13基因毒性genotoxic指所有類(lèi)型的DNA或染色體損傷，包括DNA斷裂、加合、重排、突變、染色體畸變和非整倍體。并非所有類(lèi)型的遺傳毒性效應(yīng)都會(huì)導(dǎo)致基因突變或穩(wěn)定的染色體損傷。3.14細(xì)胞毒性cytotoxicity對(duì)于本指南而言，細(xì)胞毒性是指處理組與陰性對(duì)照的存活率比較顯著下降，說(shuō)明受試物具有細(xì)胞毒3.15相對(duì)存活率relativesurvival（RS）RS是受試物細(xì)胞毒性的衡量指標(biāo)。RS是指在受試物處理后的細(xì)胞克隆的效率(CE)，其與陰性對(duì)照克隆效率的百分比。注：受試物處理時(shí)引起的細(xì)胞死亡數(shù)要考慮。3.166GB/T21786—XXXXS9肝組分S9liverfractions應(yīng)用9000g離心后的肝勻漿上清，即肝粗提物。3.17S9混合物S9mix肝臟S9組分和代謝酶活性所需輔因子的混合物。3.18溶劑對(duì)照solventcontrol單獨(dú)用于溶解化學(xué)藥品的對(duì)照組培養(yǎng)物。3.19未處理對(duì)照untreatedcontrol不接受處理(即不含試驗(yàn)化學(xué)物和溶劑)，但與接受試驗(yàn)化學(xué)物的處理培養(yǎng)物處理方式相同。4試驗(yàn)原則4.1由于TK+/-突變?yōu)門(mén)K-/-細(xì)胞缺乏TK,突變體對(duì)嘧啶類(lèi)似物三氟胸苷(TFT)細(xì)胞毒性效應(yīng)產(chǎn)生抗性。而含TK豐富的細(xì)胞則對(duì)TFT敏感，從而引起細(xì)胞代謝抑制和細(xì)胞進(jìn)一步分化。因此突變細(xì)胞能在TFT存在條件下迅速增長(zhǎng)，而正常細(xì)胞由于含TK而無(wú)法生長(zhǎng)增殖。同樣地，缺乏HPRT或XPRT的細(xì)胞分別因其對(duì)6-琉基鳥(niǎo)嘌呤(6-TG)和8-氮鳥(niǎo)嘌呤(8-AG)具有抗性可被挑選出來(lái)。如受試的是堿基類(lèi)似物或與選擇劑在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物，則在進(jìn)行任一哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮受試物的特性，判斷是否適合進(jìn)行本試驗(yàn)，例如，應(yīng)研究受試樣品對(duì)突變細(xì)胞和非突變細(xì)胞可能存在的選擇性毒性。也就是說(shuō)，在檢測(cè)與選擇劑結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物時(shí)，必須核實(shí)選擇系統(tǒng)／選擇劑特性。4.2在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下,懸浮或單層培養(yǎng)的細(xì)胞暴露于受試物一定時(shí)間(3-6小時(shí)）,然后將細(xì)胞傳代培養(yǎng),測(cè)定細(xì)胞毒性,并在選擇突變細(xì)胞前使其表型得到表達(dá)。細(xì)胞毒性一般通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞處理后的相對(duì)集落形成效率(生存能力)或集落的相對(duì)總生長(zhǎng)數(shù)。處理后的細(xì)胞在培養(yǎng)液中保持足夠時(shí)間后,根據(jù)所選細(xì)胞和突變位點(diǎn)的特性,使誘發(fā)的突變表型表達(dá)至臨近可觀察到的水平。突變率則通過(guò)在含選擇劑的培養(yǎng)基中接種已知數(shù)目的細(xì)胞檢測(cè)突變細(xì)胞數(shù),或在不含選擇劑的培養(yǎng)基中檢測(cè)集落形成效率(生存能力)。孵育適當(dāng)時(shí)向后，計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。根據(jù)選擇性培養(yǎng)液中奕變集落數(shù)和非選擇性培養(yǎng)液中集落數(shù)利用公式計(jì)算得出突變率。5試驗(yàn)方法5.1試驗(yàn)準(zhǔn)備5.1.1細(xì)胞5.1.1.1本試驗(yàn)有多種細(xì)胞類(lèi)型可供選擇,包括L5178Y亞群、CHO、AS53、V79或TK6細(xì)胞。用多種于本試驗(yàn)的細(xì)胞類(lèi)型對(duì)化學(xué)性致突變物應(yīng)具有明確的敏感性,高的集落形成效率以及穩(wěn)定的自發(fā)突變率。應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞是否被支原體感染,若已被感染則不能使用。5.1.1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)預(yù)先確定敏感性和檢測(cè)能力(power)。所用細(xì)胞數(shù),培養(yǎng)皿/瓶數(shù)和所設(shè)受試物劑量組應(yīng)能反應(yīng)這些特定的參數(shù)。經(jīng)處理后仍存活的最小細(xì)胞數(shù)以及每一試驗(yàn)階段所用的最小細(xì)胞數(shù)應(yīng)根7GB/T21786—XXXX據(jù)自發(fā)突變率確定?？偟脑瓌t是所用細(xì)胞數(shù)至少是自發(fā)突變率倒數(shù)的10倍。但推薦應(yīng)用的細(xì)胞數(shù)量是至少106個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室對(duì)所用的細(xì)胞體系應(yīng)有合適的歷史數(shù)據(jù),以用于對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)。5.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件本試驗(yàn)宜選用適宜培養(yǎng)基和孵育條件(培養(yǎng)皿、溫度、CO3體積分?jǐn)?shù)和濕度)。應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)所用的選擇系統(tǒng)和細(xì)胞類(lèi)型選擇適宜的培養(yǎng)基。特別重要的是所選的培養(yǎng)條件,應(yīng)確保在表達(dá)期細(xì)胞呈最佳生長(zhǎng)狀態(tài)且突變細(xì)胞和非突變細(xì)胞有形成集落的能力。5.1.3培養(yǎng)準(zhǔn)備從菌種培養(yǎng)基得到的細(xì)胞經(jīng)繁殖后接種于培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)。需預(yù)先清除受試細(xì)胞中的已突變細(xì)胞。5.1.4代謝活化細(xì)胞株應(yīng)在有或無(wú)外源性哺乳動(dòng)物代謝活化系統(tǒng)的條件下與受試樣品接觸。最常用的活化系統(tǒng)是經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理的,從嚙齒類(lèi)動(dòng)物肝臟制備的加有輔助因子的線粒體組分(S9)。所用的酶誘導(dǎo)劑包括Aroclor1354或苯巴比妥和β-萘黃酮的聯(lián)合誘導(dǎo)S9通常用在培養(yǎng)基中應(yīng)用的終體積分?jǐn)?shù)范圍為1%-3%，但在最終測(cè)試培養(yǎng)基中可能增加到10%。應(yīng)根據(jù)受試樣品的特點(diǎn)選擇代謝活化系統(tǒng)及其應(yīng)用條件。在某些情況下,可能使用一個(gè)以上的S9濃度。隨著代謝活化系統(tǒng)的不斷發(fā)展,目前已構(gòu)建了含有能表達(dá)特殊活性酶的基因工程細(xì)胞系,可以為細(xì)胞提供內(nèi)源性代謝活化能力。但應(yīng)按科學(xué)的方法選擇所用的細(xì)胞系(例如分析細(xì)胞色素P450同功酶與受試物代謝之間的相關(guān)性)。5.1.5受試物/準(zhǔn)備固體受試樣品應(yīng)該溶解或混懸于合適的溶劑或賦形劑中,在處理細(xì)胞前如需要可進(jìn)行適度稀釋。液體受試樣品可直接加入測(cè)定體系或在處理前適度稀釋。應(yīng)使用新鮮制備的受試物,否則應(yīng)有資料證明溶液貯存是穩(wěn)定的。氣體或者揮發(fā)性試驗(yàn)化學(xué)品應(yīng)該根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行適當(dāng)測(cè)試，如在密封的培養(yǎng)容器。除非已有數(shù)據(jù)證明受試物可以穩(wěn)定保存，否則試驗(yàn)化學(xué)品應(yīng)該在試驗(yàn)前制備。5.2試驗(yàn)條件5.2.1溶劑/賦形劑溶劑/賦形劑不應(yīng)與受試樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng),且對(duì)細(xì)胞的存活和S9的活性無(wú)影響。若選用的不是常用的溶劑或賦形劑,應(yīng)有資料支持其適用性。建議盡可能用水或二甲基亞砜作溶劑。一般有機(jī)溶劑不應(yīng)超過(guò)1%(v/v)，水溶劑(鹽水或水)不應(yīng)超過(guò)10%(v/v)。如果所用溶劑/賦形劑尚未確定(例如乙醇或丙酮)，則應(yīng)有數(shù)據(jù)證明其與試驗(yàn)化學(xué)品和試驗(yàn)系統(tǒng)的相容性，以及在所用濃度下無(wú)遺傳毒性來(lái)支持其使用。在缺乏這些支持?jǐn)?shù)據(jù)的情況下，添加未處理的對(duì)照以證明所選溶劑沒(méi)有產(chǎn)生有害或誘變效應(yīng)。5.2.3接觸濃度5.2.3.1在確定最高濃度時(shí)應(yīng)考慮受試物的細(xì)胞毒性,溶解度和pH值或滲透性的變化。5.2.3.2在正式試驗(yàn)中，細(xì)胞的毒性需在有或無(wú)代謝活化系統(tǒng)存在的條件下分別測(cè)定,可用細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)程度作為指標(biāo),例如細(xì)胞集落形成效率(存活能力)或相對(duì)總生長(zhǎng)數(shù)。在預(yù)試驗(yàn)中先測(cè)定細(xì)胞毒性和溶解性有利于正式試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。8GB/T21786—XXXX5.2.3.3至少應(yīng)設(shè)立4個(gè)受試物濃度（不包括陽(yáng)性組和對(duì)照組）以滿足測(cè)試要求。每個(gè)濃度至少有兩次重復(fù)測(cè)試。每次測(cè)試的數(shù)據(jù)應(yīng)該有單獨(dú)報(bào)告，但是在結(jié)果分析中可以放在一起進(jìn)行分析。如有細(xì)胞毒性,濃度設(shè)計(jì)應(yīng)涵蓋產(chǎn)生最大毒性到產(chǎn)生最小或不產(chǎn)生毒性的范圍。如最高濃度可產(chǎn)生細(xì)胞毒性,那么細(xì)胞存活能力(相對(duì)集落形成效率)或相對(duì)總生長(zhǎng)數(shù)應(yīng)達(dá)到10%～30%范圍內(nèi)(但不應(yīng)低于10%)。如果有數(shù)據(jù)表明受試物毒性低或者沒(méi)有細(xì)胞毒性，不同濃度的梯度在3~3倍之間即可；最高濃度至少達(dá)到10mM,3mg/mLor3μL/mL，當(dāng)測(cè)試化學(xué)品的成分不確定時(shí)，例如未知或可變成分的物質(zhì)、復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物或生物材料(即未知或可變成分的化學(xué)物質(zhì))、環(huán)境提取物等，最高濃度可能需要更高(例如5mg/mL)；在沒(méi)有足夠的細(xì)胞毒性的情況下，增加各組分的濃度。但應(yīng)該注意的是，這些要求對(duì)人類(lèi)藥物可能有所不同。5.2.3.4相對(duì)不溶的受試樣品應(yīng)盡量使其在培養(yǎng)條件下達(dá)到溶解度的限值。應(yīng)觀察細(xì)胞染毒時(shí)終處理液中不溶的證據(jù)。在處理開(kāi)始和結(jié)束時(shí)評(píng)價(jià)其溶解度可獲得有價(jià)值的資料,因?yàn)樵谠囼?yàn)體系中有細(xì)胞、S9和血清等成分存在,受試樣品的溶解度在染毒過(guò)程中可能發(fā)生改變。不溶現(xiàn)象可通過(guò)肉眼觀察。5.2.4對(duì)照5.2.4.1每次試驗(yàn)均應(yīng)在有和無(wú)代謝活化系統(tǒng)的條件下同時(shí)設(shè)置的陽(yáng)性和陰性(溶劑或賦形劑)對(duì)照。在使用代謝活化系統(tǒng)時(shí),選用的陽(yáng)性物應(yīng)是需要活化才具有致突變作用的間接致突變物。5.2.4.2可用作陽(yáng)性對(duì)照的化學(xué)品有以下幾種,見(jiàn)表1。表1可用作陽(yáng)性對(duì)照的化學(xué)品TK（小和大HprtTK（小和大No.50-18-0(6055-19-35.2.4.3也可以使用其他適合的陽(yáng)性對(duì)照參比物。如某試驗(yàn)室有5-溴3'-脫氧尿苷[CASNo.59-14-3]的歷史性數(shù)據(jù),則也可以將其作為陽(yáng)性對(duì)照參比物。如可能,也可考慮使用與受試物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物作為陽(yáng)性對(duì)照。5.2.4.4在每次試驗(yàn)時(shí),陰性對(duì)照除在試驗(yàn)培養(yǎng)基中只加入溶劑或賦形劑外,其余處理應(yīng)與各處理組相同。另外,如果沒(méi)有歷史數(shù)據(jù)證明所用溶劑或賦形劑無(wú)毒性作用或致突變作用,還應(yīng)設(shè)不做任何處理的空白對(duì)照組。5.3試驗(yàn)步驟9GB/T21786—XXXX5.3.1受試樣品處理5.3.1.1在有或無(wú)代謝活化系統(tǒng)存在的情況下,分別使增殖細(xì)胞與受試樣品接觸適當(dāng)時(shí)間(通常3h～6h即有效)。接觸時(shí)間也可延長(zhǎng)至一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期。5.3.1.3在試驗(yàn)的每個(gè)階段，用于每個(gè)試驗(yàn)(對(duì)照和處理)培養(yǎng)的最小細(xì)胞數(shù)應(yīng)基于自發(fā)突變頻率。一般原則是：在試驗(yàn)的所有階段，處理和傳代的細(xì)胞，在每個(gè)培養(yǎng)瓶自發(fā)突變體不高于10。自發(fā)突變頻率在5~30×10-6之間。如果自發(fā)突變頻率為5×10-6，且自發(fā)突變數(shù)在10及以上時(shí)，可導(dǎo)致90%的細(xì)胞毒性(10%RS)，此時(shí)，細(xì)胞數(shù)至少30×106。此外，在突變選擇或表細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的數(shù)量不應(yīng)低于300萬(wàn)個(gè)。5.3.3存活能力、生存能力和突變率的檢測(cè)5.3.3.1在受試物染毒末期,細(xì)胞經(jīng)洗滌、培養(yǎng),以檢測(cè)存活能力,并使突變體的表型獲得表達(dá)。細(xì)胞毒性的檢測(cè)通常以染毒后開(kāi)始測(cè)定的相對(duì)集落形成效率(存活能力)或相對(duì)總生長(zhǎng)數(shù)來(lái)表示。5.3.3.3每個(gè)突變位點(diǎn)的新誘發(fā)突變體,其最佳表型表達(dá)需要經(jīng)過(guò)(有)最短時(shí)間(HPRT和XPRT位點(diǎn)突變需要至少7d～9d,TK至少3d)。細(xì)胞在含選擇劑和不含選擇劑的培養(yǎng)液中生長(zhǎng),以分別測(cè)定突變體數(shù)目和集落形成效率。生存能力的檢測(cè)(用于計(jì)算突變效率)可以從表達(dá)期結(jié)束時(shí)開(kāi)始,通過(guò)檢測(cè)接種在非選擇性培養(yǎng)基中的細(xì)胞來(lái)實(shí)施。5.3.3.3如果受試物在L5178YTK+/-試驗(yàn)中為陽(yáng)性,至少應(yīng)測(cè)定一個(gè)受試樣品濃度(最高的陽(yáng)性濃度)以及陰性和陽(yáng)性對(duì)照中的集落大小。如受試樣品在L5178YTK+/-試驗(yàn)結(jié)果為陰性,應(yīng)測(cè)定陰性和陽(yáng)性對(duì)照的集落大小。6試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告6.1結(jié)果的處理6.1.1數(shù)據(jù)應(yīng)包括處理組和對(duì)照組的細(xì)胞毒性和生存能力,集落計(jì)數(shù)和突變率。如L5178YTK+/-試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性,應(yīng)分別計(jì)數(shù)至少一個(gè)受試樣品濃度(最高陽(yáng)性濃度)以及陰性和陽(yáng)性對(duì)照的大集落和小集落數(shù)。在TK+-試驗(yàn)中,集落計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為正常生長(zhǎng)集落(大集落)和慢生長(zhǎng)集落(小集落)。小集落的成因是突變細(xì)胞受到嚴(yán)重的遺傳損傷,導(dǎo)致倍增期延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量增加緩慢,典型的此類(lèi)損傷范圍包括從整個(gè)基因的缺失至細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)的典型染色體畸變。小的突變集落的誘發(fā)與化學(xué)品誘發(fā)顯著的染色體畸變有關(guān)。損傷較輕的突變細(xì)胞生長(zhǎng)速率與親代細(xì)胞相似，可形成較大的集落。6.1.2應(yīng)提供存活能力(相對(duì)集落形成效率)或相對(duì)總的生長(zhǎng)率數(shù)據(jù)。突變率可以用存活細(xì)胞數(shù)中突變細(xì)胞數(shù)所占比例來(lái)表示。6.1.3應(yīng)提供每次培養(yǎng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外,所有數(shù)據(jù)應(yīng)以表格形式列出。6.1.4對(duì)明確的陽(yáng)性結(jié)果無(wú)需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。意義不明確的結(jié)果最好通過(guò)改進(jìn)試驗(yàn)條件進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)澄清。陰性結(jié)果需視具體情況決定。如認(rèn)為陰性結(jié)果無(wú)需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),應(yīng)提供依據(jù)。對(duì)可疑或陰性結(jié)果,在以后的試驗(yàn)中應(yīng)改進(jìn)試驗(yàn)參數(shù)以擴(kuò)大試驗(yàn)條件范圍,可改進(jìn)的參數(shù)包括濃度間隔、代謝活化條件等。落大小。在使用TK6細(xì)胞株的TK+/-試驗(yàn)中,也應(yīng)測(cè)定集落大小。6.2結(jié)果評(píng)價(jià)和解釋6.2.1陽(yáng)性結(jié)果判定有多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。如有劑量反應(yīng)關(guān)系,或突變率增加,且結(jié)果可重復(fù)。應(yīng)首先考慮結(jié)果的生物學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可用于幫助試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià),但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不能作為陽(yáng)性反應(yīng)判定的唯一因素。GB/T21786—XXXX6.2.3不符合以上標(biāo)準(zhǔn)的受試樣品則被認(rèn)為在本試驗(yàn)體系中無(wú)致突變性。6.2.3盡管大多數(shù)試驗(yàn)都能給出明確的陽(yáng)性或陰性的結(jié)果,但也不排除極少數(shù)情況不能對(duì)受試物活性做出明確判斷,例如,無(wú)論重復(fù)試驗(yàn)多少次,結(jié)果仍模校兩可或可疑。6.2.4體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性結(jié)果,表明受試樣品可引起所用哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變。有可重復(fù)的濃度-反應(yīng)關(guān)系意義較大。陰性結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下,受試樣品不引起所用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因突變。6.3試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下信息:6.3.1樣品a)名稱(chēng)和識(shí)別碼如CAS編號(hào)(如已知);b)物理性質(zhì)和純度;c)與試驗(yàn)實(shí)施相關(guān)的物理化學(xué)特性;d)受試樣品穩(wěn)定性。e)多組分物質(zhì)、uvb及混合物6.3.2賦形劑a)選擇溶劑/賦形劑的理由;b)最終培養(yǎng)基中溶劑/賦形劑的百分比。6.3.3細(xì)跑a)細(xì)胞類(lèi)型和來(lái)源;b)細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶數(shù)量;c)細(xì)胞傳代的次數(shù)(如適用);d)細(xì)胞培養(yǎng)的維護(hù)方法(如適用);e)沒(méi)有支原體的證據(jù)。e)核型特征/或染色體模式數(shù)f)細(xì)胞倍增時(shí)間6.3.4試驗(yàn)條件a)細(xì)胞濃度和細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量選擇的理由,包括細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)和溶解度限值等(如可能);b)培養(yǎng)基成分、CO2濃度、體積分?jǐn)?shù);c)受試樣品濃度;d)所加入的賦形劑和受試樣品的體積;e)孵育溫度;f)孵育時(shí)間;g)處理持續(xù)的時(shí)間;h)細(xì)胞處理時(shí)的密度;i)代謝活化系統(tǒng)的類(lèi)型和成分,包括可接受的標(biāo)準(zhǔn)（S9來(lái)源、S9混合料的制備方法、S9混合料和S9在最終培養(yǎng)基中的濃度、S9的質(zhì)量控制）;GB/T21786—XXXXj)陽(yáng)性和陰性對(duì)照;k)表達(dá)期長(zhǎng)短(包括細(xì)胞接種數(shù),傳代和接種程序及所加培養(yǎng)液,如適用);1)選擇劑及其濃度特征:m)測(cè)試可接受性的標(biāo)準(zhǔn);n)計(jì)數(shù)存活細(xì)胞和突變細(xì)胞的方法;o)集落大小和類(lèi)型認(rèn)定的定義(包括所謂小集落和大集落的標(biāo)準(zhǔn),如適用)。p)考慮研究為肯定、否定或者存疑的標(biāo)準(zhǔn)6.3.5結(jié)果a)細(xì)胞毒性和其他觀察到的結(jié)局;b)沉淀現(xiàn)象和測(cè)定時(shí)間;c)受試樣品接觸過(guò)程中的pH值和滲透性數(shù)據(jù)(如可確定);d)集落大小(至少包括陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的數(shù)據(jù));e)實(shí)驗(yàn)室具備檢測(cè)L5178YTK+/-體系小突變集落能力的說(shuō)明(如適用);f)劑量-反應(yīng)關(guān)系(如有);g)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(適用與單次或多次重復(fù)數(shù)據(jù))，p值，如果有；h)同期的陰性(溶劑/賦形劑)和陽(yáng)性對(duì)照數(shù)據(jù);i)同時(shí)陰性和陽(yáng)性對(duì)照數(shù)據(jù)（濃度和溶劑）j)突變率。6.3.6結(jié)果討論6.3.7結(jié)論6.3.8注：歷史對(duì)照數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立:-本實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性對(duì)照范圍和95%可信區(qū)間-本實(shí)驗(yàn)室陰性(未處理，溶劑)對(duì)照范圍和95%可信區(qū)間。當(dāng)首次獲得陰性對(duì)照范圍的數(shù)據(jù)，相應(yīng)的陰性對(duì)照應(yīng)與發(fā)表的對(duì)照數(shù)據(jù)一致。隨著陰性對(duì)照的數(shù)據(jù)越來(lái)越多，理想的陰性對(duì)照應(yīng)在該對(duì)照的均數(shù)95%控制限以內(nèi)。開(kāi)始建立實(shí)驗(yàn)室的歷史陰性對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，應(yīng)至少有10次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的至少30次實(shí)驗(yàn)為更好。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用質(zhì)量控制方法，例如控制圖(例如c圖或x條形圖[i])，以識(shí)別其陽(yáng)性和陰性對(duì)照數(shù)據(jù)的變異，并表明該方法在其實(shí)驗(yàn)室是“可控”。陰性對(duì)照數(shù)據(jù)應(yīng)包括單個(gè)或兩個(gè)陽(yáng)性物處理后的突變頻率。相應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，陰性對(duì)照最好在實(shí)驗(yàn)室歷史陰性對(duì)照數(shù)據(jù)的95%范圍內(nèi)。如果陰性數(shù)據(jù)不在95%的控制線，這些陽(yáng)性數(shù)據(jù)要想應(yīng)用，其條件