化學(xué)品 嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)方法 征求意見稿

4GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)的試驗(yàn)?zāi)康?、術(shù)語和定義、試驗(yàn)基本原理、試驗(yàn)程序、結(jié)果評價(jià)、試驗(yàn)報(bào)告和結(jié)果解釋。本文件適用于檢測化學(xué)品對整體嚙齒類動物生殖細(xì)胞染色體的損傷。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義3.1黃體corporaluteum在釋放卵細(xì)胞的卵泡部位形成的激素分泌結(jié)構(gòu)。卵巢中黃體的數(shù)量與排卵的卵數(shù)相對應(yīng)。3.2顯性致死突變dominantlethalmutation發(fā)生在生殖細(xì)胞中或受精后固定的突變，導(dǎo)致胚胎或胎兒死亡。3.3交配間隔matinginterval染毒組雄性接觸結(jié)束到交配之間的時(shí)間。通過控制交配間隔，可以評估對不同類型生殖細(xì)胞的化學(xué)影響。在小鼠1、2、3、4、5、6、7和8周內(nèi)，可分別測量對精子、致密精子細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞、早期精母細(xì)胞、已分化精原細(xì)胞、分化中的精原細(xì)胞和干細(xì)胞精原細(xì)胞的影響。4試驗(yàn)?zāi)康谋驹囼?yàn)是一項(xiàng)生殖細(xì)胞致突變試驗(yàn)，用來檢測整體嚙齒類動物生殖細(xì)胞染色體畸變，迸一步確證體外試驗(yàn)或其他試驗(yàn)系統(tǒng)獲得的陽性結(jié)果，以評價(jià)受試樣品能否到達(dá)性腺組織產(chǎn)生遺傳危害。5試驗(yàn)基本原理通過適當(dāng)?shù)耐緩绞剐坌詣游锝佑|受試樣品，然后與未經(jīng)染毒且未交配過的雌性動物交配，交配結(jié)束后，取出雌性動物。雌性動物于妊娠后半期處死，剖開腹腔，取出子宮，檢查兩側(cè)子宮內(nèi)的黃體數(shù)、植入數(shù)(著床數(shù))、死胎數(shù)、活胎數(shù)，計(jì)算受孕率、著床前損失、著床后損失等參數(shù)。雄性動物則于一定間5GB/TXXXXX—XXXX隔時(shí)間后再與另一批未經(jīng)染毒且未交配過的雌性動物交配，如此共進(jìn)行數(shù)批，以保證覆蓋一個(gè)精子周期。比較染毒組與對照組各參數(shù)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，評估受試物的顯性致死效應(yīng)。6試驗(yàn)程序6.1受試樣品處理受試樣品應(yīng)新鮮配制。除非有資料表明此溶液(或乳濁液、懸濁液等)保存具有穩(wěn)定性。固體受試樣品應(yīng)溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)娜軇┗蛸x形劑中，并進(jìn)行稀釋。液體受試樣品可直接使用或稀釋后使用。根據(jù)受試樣品的理化性質(zhì)(水溶性/脂溶性)確定受試樣品所用的溶劑或賦形劑。對于吸入暴露，受試樣品可根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)，作為氣體、蒸氣或固體/液體氣溶膠使用。通常采用水、生理鹽水、甲基纖維素溶液、羧甲基纖維素鈉鹽溶液、橄欖油和玉米油等作為溶劑或賦形劑。如非常用溶劑或賦形劑，應(yīng)有參考資料說明其成分。6.2對照每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的陽性對照和陰性對照，陰性對照除不使用受試樣品外，其他處理與受試樣品組一致。當(dāng)所使用的溶劑沒有文獻(xiàn)資料或歷史性資料證明其無有害作用或無致突變性作用時(shí)，還應(yīng)設(shè)未處理對照組。若一年之內(nèi)已從試驗(yàn)中獲得了有效的陽性對照結(jié)果，則在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行本試驗(yàn)時(shí)可不設(shè)陽性對照組。應(yīng)該使用已被證明在較低劑量水平即對顯性致死敏感的陽性對照物，常用的陽性對照物見表1。表1.陽性物質(zhì)及其使用劑量劑量（mg/kg動物種類）1515516.3實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境首選小鼠和大鼠。應(yīng)選用健康的性成熟動物以保證足夠的交配和受孕率。動物平均體重差異按性別不能超過+20％。雌鼠應(yīng)為未交配過鼠，且為雄鼠的12～18倍量。動物應(yīng)隨機(jī)分組，每個(gè)染毒組和對照組雄鼠一般不少于15只，要求每組每周至少有30-40只受孕雌鼠（以保證產(chǎn)生至少400個(gè)著床點(diǎn)）。動物購回后應(yīng)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室新環(huán)境不少于5d。動物室內(nèi)的溫度應(yīng)為22℃(±3℃)。相對濕度最好為50-60%，除房間清潔期間外，應(yīng)至少為40%，最高不超過70%。人工照明，12h明暗交替。6.4劑量設(shè)計(jì)6GB/TXXXXX—XXXX受試樣品至少設(shè)三個(gè)劑量組，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以確定最高劑量。劑量組的劑量間距以2～4倍為宜。試驗(yàn)應(yīng)力求得出最大耐受劑量。對照組除不接觸受試樣品外，其他條件應(yīng)與染毒組完全相同。必要時(shí)可設(shè)賦形劑對照組，以研究賦形劑的影響。對照組中賦形劑的濃度可采用高濃度組的賦形劑用量。受試樣品毒性較低時(shí)，給藥時(shí)間為14天或以上的限制劑量為1000mg/kg體重/天，給藥時(shí)間少于14天的限制劑量為2000mg/kg體重/天。6.5試驗(yàn)步驟6.5.1染毒方式與途徑根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康幕蚴茉嚇悠返男再|(zhì)，并考慮預(yù)期的人體暴露途徑來選擇染毒途徑，可以選擇飲食、飲用水、皮下、靜脈、局部、吸入、口服（灌胃）或植入等暴露途徑。不建議腹腔注射（陽性對照除外因?yàn)樗皇侨祟惐┞兜念A(yù)期途徑，除非有其他特殊考慮。受試樣品溶液一次給予的最大體積通常不應(yīng)超過1ml/100g體重，水溶液中最多可使用2ml/100g體重。雄鼠預(yù)先接觸受試樣品，再進(jìn)行交配。雌鼠不接觸受試樣品。6.5.2交配方式雄鼠接觸受試樣品后的當(dāng)天(染毒一次)或最后一次接觸受試樣品后的當(dāng)天(多次染毒)，按1：1或2：1的雌雄鼠比例同籠交配，期間每天陰道涂片或肉眼觀察到陰栓以確定交配時(shí)間。5d后取出雌鼠另行飼養(yǎng)。雄鼠則于2d后再與同樣數(shù)量的另一批未交配的雌鼠同籠交配，小鼠連續(xù)6周~8周,大鼠連續(xù)8周~12周，以保證覆蓋一個(gè)精子周期。6.5.3臨床觀察對試驗(yàn)動物進(jìn)行一般臨床觀察，并每天至少記錄一次臨床體征，最好是每天同一時(shí)間，并考慮給藥后預(yù)期效果的高峰期。所有的動物都應(yīng)在研究開始時(shí)稱重，重復(fù)劑量研究期間至少每周稱重一次，并在安樂死時(shí)稱重。至少每周測量食物消耗量。如果受試物是通過飲用水給藥，每周還應(yīng)測量水消耗量。中毒癥狀過重的動物應(yīng)在完成實(shí)驗(yàn)前實(shí)施安樂死。6.5.4組織收集和處理雌鼠在妊娠期的后半段處死（小鼠13天，大鼠14-15天）。檢查子宮和卵巢，計(jì)數(shù)黃體、著床點(diǎn)（植入點(diǎn)）、活胎數(shù)、死胎數(shù)、著床前損失、著床后損失（包括早期吸收胎和晚期吸收胎）?？梢姷奶嚎梢栽贐ouin’s固定液中保存至少2周，然后檢查主要的外部畸形，以提供關(guān)于生殖和發(fā)育影響的其他信息。6.6結(jié)果處理與評價(jià)6.6.1應(yīng)以表格的形式列出雄鼠數(shù)、孕鼠數(shù)和未受孕雌鼠數(shù)。應(yīng)分別記錄每次每對雌雄鼠交配的情況。對每只雌鼠而言，還應(yīng)詳細(xì)記錄其交配間隔、與之交配的雄鼠接觸受試樣品的劑量以及活胎數(shù)、死胎數(shù)、著床前損失、著床后損失等情況。6.6.2按式（1）~（4）計(jì)算各組別下列指標(biāo)，并根據(jù)數(shù)據(jù)特點(diǎn)選用合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。7GB/TXXXXX—XXXX著床前損失率=黃體床數(shù)×100％ 著床后損失率=×100％ （顯性致死指數(shù)=×100 （4）6.6.3結(jié)果評價(jià)陽性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:a)受孕率顯著降低;b)著床前損失或著床后損失明顯升高。染毒組與對照組比較，上述指標(biāo)存在劑量-反應(yīng)關(guān)系且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或至少有一種指標(biāo)明顯改變并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，即可判為該受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中的試驗(yàn)結(jié)果為陽性。如果受試物不引起上述指標(biāo)與劑量有關(guān)的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變，或者在任何劑量水平上均沒有可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變，則可認(rèn)為該受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中的試驗(yàn)結(jié)果為陰性。7試驗(yàn)報(bào)告7.1受試樣品名稱、來源、批號、限制使用日期、理化性狀、穩(wěn)定性、配制方法、所用濃度等。單成分物質(zhì)需提供物理外觀、水溶性和其他相關(guān)物理化學(xué)性質(zhì)、CAS編號、結(jié)構(gòu)公式、純度、雜質(zhì)的化學(xué)身份等。多組分物質(zhì)和混合物則需要盡可能通過化學(xué)特性、相關(guān)的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。7.2選擇溶劑/賦形劑的理由以及化學(xué)品在溶劑/賦形劑中的溶解度、穩(wěn)定性、均一性。7.3實(shí)驗(yàn)動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）、性別、體重范圍和（或）周齡、喂養(yǎng)方式；短期研究在測試開始和結(jié)束時(shí)雄性動物的個(gè)體體重，研究時(shí)間超過一周的則需報(bào)告研究期間的個(gè)體體重和食物消費(fèi)，應(yīng)包括各組的體重范圍、均值和標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源(對非標(biāo)準(zhǔn)飼料應(yīng)注明飼料的配方)、室溫、相對濕度，動物實(shí)驗(yàn)室和飼料的合格證號；劑量設(shè)計(jì)和動物分組方法，每組所用動物性別、數(shù)量及初始體重范圍。7.4劑量分組及選擇劑量的基本原則，陽性和陰性對照資料(包括當(dāng)前和歷史的資料)、染毒途徑和方式、實(shí)際劑量。動物觀察和體重情況。動物福利信息，分離和保存組織的程序，所有試劑盒和試劑的來源和批號。交配時(shí)間表，用于確定交配是否發(fā)生的方法，顯性致死效應(yīng)的各項(xiàng)評分標(biāo)準(zhǔn)，包括黃體數(shù)、著床數(shù)、著床前損失、著床后損失、活胎、死胎等。8GB/TXXXXX—XXXX7.5試驗(yàn)前和整個(gè)試驗(yàn)期間的動物狀況，包括中毒癥狀；染毒和交配期間的雄性體重；交配的雌性數(shù)量；劑量-反應(yīng)關(guān)系；陰性對照的參考資料及歷史資料、陽性對照的參考資