動(dòng)物染色體工程

動(dòng)物染色體工程AnimalChromosomeEngineering◆認(rèn)識(shí)染色體與染色體組◆什么是染色體工程◆動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容染色體組工程個(gè)別染色體工程人工染色體一、認(rèn)識(shí)染色體1.染色體的組成與DNA、基因之間的關(guān)系2.染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分類3.染色體DNA的3種功能元件4.染色體組1、真核細(xì)胞染色體的組成組蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4；非組蛋白：HMG、DNA結(jié)合蛋白DNA：不重復(fù)序列；中度重復(fù)序列；高度重復(fù)序列少量的RNA；2、染色體的主要結(jié)構(gòu)◆著絲粒(centromere)●主縊痕(Primaryconstriction)

◆次縊痕(secondaryconstriction)◆動(dòng)粒(kinetochore)◆核仁組織區(qū)(nucleolarorganizingregion,NOR)◆隨體(satellite)◆端粒(telomere)根據(jù)著絲點(diǎn)的位置而定，可將中期染色體分為四種：中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體、端著絲粒染色體、近端著絲粒染色體。染色體的超微結(jié)構(gòu)核小體是染色體包裝的基本單位；染色體包裝的螺線管模型：核小體的結(jié)構(gòu)

每一個(gè)核小體核心包含有146bpDNA和8個(gè)組蛋白分子（2H2A，2H2B，2H3，2H4）；DNA在每個(gè)組蛋白核心外纏繞約2圈染色體的串珠狀形式與螺線管結(jié)構(gòu)146bpDNA的核小體核心由54bp間隔DNA連成一條串珠狀結(jié)構(gòu)；核小體螺旋形纏繞形成螺線管結(jié)構(gòu)，每一周螺旋含6個(gè)核小體，因此，DNA長(zhǎng)度縮短了6倍。從DNA到染色體的包裝壓縮DNA鏈核小體螺線管染色單體超螺旋壓縮比例：7×6×40×5=8400（1：7）（1：6）（1：40）（1：5）DNAPackagingGeneExpression3、染色體DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定遺傳的功能序列◆ARS(autonomousreplicatingsequence)◆CEN(centromericsequence)

Thecentromereisaspecializedregionofthechromosomethatplaysacriticalroleinensuringthecorrectdistributionofduplicatedchromosomestodaughtercellsduringmitosis

◆TEL(telomericsequence)

Thesequencesattheendsofeukaryoticchromosomes,calledtelomeres,playcriticalrolesinchromosomereplicationandmaintenance.DNA穩(wěn)定遺傳的三種功能位點(diǎn)⑶不能用簡(jiǎn)單的方法將人工染色體與酵母染色體分開(kāi)。缺失：染色體的某一區(qū)段及帶有的基因一起丟失細(xì)胞分裂的阻止（抑制第二極體排出，發(fā)育成二倍體）(3n=72)廣義上講它還包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)。流式細(xì)胞儀

FlowCytometry1、Yeastartificialchromosome單倍體：細(xì)胞中含有正常體細(xì)胞的一半染色體數(shù)阻止細(xì)胞分裂過(guò)程中的紡綞體的形成。廣義上講它還包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)。染色體組工程Thecentromereisaspecializedregionofthechromosomethatplaysacriticalroleinensuringthecorrectdistributionofduplicatedchromosomestodaughtercellsduringmitosis糖類、蛋白質(zhì)及其它產(chǎn)物的含量也有所提高。染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失◆動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容4、染色體組◆染色體組◆染色體組型◆染色體倍性體細(xì)胞中的一組非同源染色體，它們?cè)谛螒B(tài)和功能上各不相同，但是，攜帶著控制一種生物生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個(gè)染色體組。

染色體組型是指一個(gè)體細(xì)胞中全部染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)特征。

染色體倍性是指細(xì)胞中包含的染色體組數(shù)或基數(shù)。HumanmitoticchromosomesandkaryotypeChromosomepainting=multicolorFISH染色體組用符號(hào)“X”表示

生物體的體細(xì)胞染色體數(shù)用2n表示，無(wú)論是二倍體還是多倍體，2n只表示體細(xì)胞的染色體數(shù)，并不表示其倍性如：玉米體細(xì)胞染色體數(shù)2n=20，普通小麥體細(xì)胞染色體數(shù)2n=42，要正確表示倍性應(yīng)寫成：玉米2n=2X=20，普通小麥2n=6X=42。符號(hào)“n”和“X”的區(qū)別與聯(lián)系單倍體與一倍體含義相同嗎？AnimalChromosomeEngineering◆認(rèn)識(shí)染色體與染色體組◆什么是染色體工程◆動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容染色體組工程個(gè)別染色體工程人工染色體

染色體工程:

是人們按照一定的設(shè)計(jì),有計(jì)劃地消減、添加或代換同種或異種染色體的技術(shù)。 廣義上講它還包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)。二、什么是染色體工程染色體數(shù)目變異整倍變化：多倍體：細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染色體組的個(gè)體單倍體：細(xì)胞中含有正常體細(xì)胞的一半染色體數(shù)非整倍體變化：染色體減少：?jiǎn)误w（減1條）、缺體（減1對(duì)）染色體增加：三體（加1條）、四體（加1對(duì)）染色體代換：同種代換、異種代換染色體數(shù)變異一是體細(xì)胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進(jìn)行的整倍性變化，以整倍體染色體數(shù)目變化產(chǎn)生的變異會(huì)產(chǎn)生多倍體和單倍體；另一種是染色體組內(nèi)的個(gè)別染色體數(shù)目有所增減，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，因此被稱為非整倍體。染色體結(jié)構(gòu)變異易位：一個(gè)染色體上某一區(qū)段跟另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換缺失：染色體的某一區(qū)段及帶有的基因一起丟失倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。染色體結(jié)構(gòu)變異染色體易位：一個(gè)染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)。染色體重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。缺失：缺失一個(gè)片段。重復(fù)：某一片斷重復(fù)出現(xiàn)。倒位：片段斷裂，倒轉(zhuǎn)180度，重新連接。易位：片段斷裂，移到另一條染色體臂上。AnimalChromosomeEngineering◆認(rèn)識(shí)染色體與染色體組◆什么是染色體工程◆動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容染色體組工程個(gè)別染色體工程人工染色體（一）動(dòng)物染色體倍性改造1、動(dòng)物的多倍體育種自然界中存在多倍體動(dòng)物嗎？人工誘導(dǎo)多倍體有什么意義？誘導(dǎo)方法倍性鑒定2、動(dòng)物的單倍體育種后代是單倍體嗎？1、人工誘導(dǎo)多倍體◆人工誘導(dǎo)多倍體的意義◆人工誘導(dǎo)多倍體的途徑◆人工誘導(dǎo)多倍體的方法◆多倍體性鑒定方法（1）人工誘導(dǎo)多倍體的意義

多倍體(polyploidy):

多倍體動(dòng)物如兩棲類、魚(yú)類、貝類都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率水產(chǎn)養(yǎng)殖增強(qiáng)抗病能力、提高生長(zhǎng)速度特點(diǎn)多倍體與二倍體相比，最顯著的特點(diǎn)是形態(tài)上的巨大性。糖類、蛋白質(zhì)及其它產(chǎn)物的含量也有所提高。由于多倍體動(dòng)物具有生長(zhǎng)速度快、成活率高及抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以可通過(guò)人工誘導(dǎo)多倍體來(lái)改善生物的經(jīng)濟(jì)性狀。（2）人工誘導(dǎo)多倍體的途徑

其一：原種或雜種所形成染色體未減數(shù)的配子受精而產(chǎn)生的。

（自然形成途徑）

其二：原種或雜種的合子或體細(xì)胞染色體數(shù)目加倍而成的。

（人工誘導(dǎo)途徑）（3）人工誘導(dǎo)多倍體的方法◆生物學(xué)方法◆物理學(xué)方法◆化學(xué)方法◆生物學(xué)方法

動(dòng)物通過(guò)雜交方法尤其是種間雜交獲得異源多倍體。種間雜交導(dǎo)致第二極體不排出。

草魚(yú)♀×♂三角魴

(2n=48)(2n=48)

草魴雜種(3n=72)

◆Assemblyofmicrotubules●Assemblyinvitro影響微管穩(wěn)定的因素◆物理學(xué)方法（1）A、溫度休克法原理：引起細(xì)胞內(nèi)酶構(gòu)型的變化，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞分裂時(shí)形成紡綞絲所需的ATP供應(yīng)受阻。抑制第二極體的釋放，誘導(dǎo)三倍體或四倍體方法：冷休克法（0-5℃）和熱休克法（30℃左右）特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，成本低廉，對(duì)胚胎發(fā)育影響小，有利于養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模生產(chǎn)使用適用：冷水魚(yú)類應(yīng)用熱休克法，溫水性魚(yú)類用冷休克效果較好關(guān)鍵：成功阻止第二次成熟分裂和第二極體的排出◆物理學(xué)方法（2）B、水靜壓法原理：抑制第二極體的排出或第一次卵裂方法：65kg/cm2特點(diǎn)：誘導(dǎo)率高（90％以上），處理時(shí)間短，對(duì)受精卵損傷小，成活率高。該法需要專門的設(shè)備——水壓機(jī)，成本較高，不適于大規(guī)模生產(chǎn)?！艋瘜W(xué)方法A.細(xì)胞松馳素B(cytochalasin)： 能抑制肌動(dòng)蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂，使用最早、最廣泛，其誘導(dǎo)效果也最突出。B.秋水仙素(colchicine)： 阻止細(xì)胞分裂過(guò)程中的紡綞體的形成。C.其他： 咖啡因、6-DMAP、聚乙二醇特點(diǎn)：化學(xué)藥物價(jià)格昂貴，有毒性廣義上講它還包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)。◆隨體(satellite)細(xì)胞分裂的阻止（抑制第二極體排出，發(fā)育成二倍體）人類和哺乳動(dòng)物的基因組很大，甚至許多單個(gè)基因也相當(dāng)大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。染色體DNA的3種功能元件分（離目的基因）◆隨體(satellite)玉米體細(xì)胞染色體數(shù)2n=20，方法：冷休克法（0-5℃）和熱休克法（30℃左右）染色體代換：同種代換、異種代換廣義上講它還包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)。雌核發(fā)育具有產(chǎn)生單性種群的能力優(yōu)點(diǎn)：能攜帶大片段DNA，約300kb。染色體重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。例：多倍體魚(yú)類生產(chǎn)三倍體魚(yú)類：阻止第二極體的排出直接生產(chǎn)三倍體四倍體個(gè)體與二倍體正常個(gè)體雜交四倍體魚(yú)類生產(chǎn)：阻止受精卵的第一次卵裂（4）多倍體性鑒定方法◆核體積測(cè)量：用紅血球、腦細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、網(wǎng)膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞?！舻鞍踪|(zhì)電泳：如血清蛋白電泳?！羯治觯喝缂∪馀c血液的化學(xué)組成。◆染色體計(jì)數(shù)：用胚胎細(xì)胞染色體，魚(yú)類再生鰭或淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的染色體標(biāo)本等◆DNA含量測(cè)定：用流式細(xì)胞儀測(cè)定流式細(xì)胞儀

FlowCytometry

Flowcytometryusesanelectronicinstrumentthatpassesparticlesorcellsonebyonethroughalaserandpastsensorsthatmeasurephysicalandchemicalcharacteristicsofthoseparticlesorcells.例：多倍體魚(yú)類生產(chǎn)三倍體魚(yú)類：阻止第二極體的排出直接生產(chǎn)三倍體四倍體個(gè)體與二倍體正常個(gè)體雜交四倍體魚(yú)類生產(chǎn)：阻止受精卵的第一次卵裂2、動(dòng)物雌雄核發(fā)育

——單倍體育種

雌核發(fā)育：精子雖然正常地鉆入和激活卵子，但精子的細(xì)胞核并未參與卵球的發(fā)育，精子的染色體很快消失，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳控制下進(jìn)行

雄核發(fā)育：因經(jīng)過(guò)紫外線、X射線和γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體2、動(dòng)物雌雄核發(fā)育

——單倍體育種●Assemblyinvitro◆人工誘導(dǎo)多倍體的意義然而事實(shí)上，男性的精子不僅使作為高級(jí)哺乳動(dòng)物的人類代代相傳、繁衍生息，而且還把男性特有的染色體(DNA)信息和信使RNA(tRNA)傳遞給后代，而tRNA絕對(duì)不是可有可無(wú)的，它是幫助胚胎產(chǎn)生、發(fā)育、正常生長(zhǎng)，最終長(zhǎng)成胎兒的重要物質(zhì)。◆蛋白質(zhì)電泳：如血清蛋白電泳。一是體細(xì)胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進(jìn)行的整倍性變化，以整倍體染色體數(shù)目變化產(chǎn)生的變異會(huì)產(chǎn)生多倍體和單倍體；原理：抑制第二極體的排出或第一次卵裂流式細(xì)胞儀

FlowCytometry多倍體動(dòng)物如兩棲類、魚(yú)類、貝類都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率核小體螺旋形纏繞形成螺線管結(jié)構(gòu)，每一周螺旋含6個(gè)核小體，因此，DNA長(zhǎng)度縮短了6倍。染色體DNA的3種功能元件◆人工誘導(dǎo)多倍體的意義◆動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容個(gè)別染色體工程廣義上講它還包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)。（1）人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法精子遺傳物質(zhì)的失活（假受精）輻射處理：γ射線（通常用60Co或173Cs)，X射線和紫外線化學(xué)處理：甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等顯微手術(shù)法：直接除去受精卵中的雄原核。細(xì)胞分裂的阻止（抑制第二極體排出，發(fā)育成二倍體）溫度休克法：冷休克、熱休克流體靜水壓作用：化學(xué)制劑處理：細(xì)胞松馳素B、聚乙二醇“無(wú)父之鼠”繼2004年4月英國(guó)《自然》雜志發(fā)表有關(guān)“沒(méi)有父親的小鼠誕生”的研究后，5月，同樣是《自然》雜志又發(fā)表了一個(gè)針?shù)h相對(duì)的研究成果。美國(guó)密執(zhí)安州立韋恩大學(xué)的斯蒂芬·克拉維茨等人的研究證明，過(guò)去男性在生殖和遺傳中的作用，被人們大大低估了，以前的研究認(rèn)為男性只是在生育中貢獻(xiàn)了自己的DNA。然而事實(shí)上，男性的精子不僅使作為高級(jí)哺乳動(dòng)物的人類代代相傳、繁衍生息，而且還把男性特有的染色體(DNA)信息和信使RNA(tRNA)傳遞給后代，而tRNA絕對(duì)不是可有可無(wú)的，它是幫助胚胎產(chǎn)生、發(fā)育、正常生長(zhǎng)，最終長(zhǎng)成胎兒的重要物質(zhì)?！舸坪税l(fā)育的鑒別

鑒別雌核發(fā)育的個(gè)體，通常以顏色、形態(tài)和生化等方面的指標(biāo)為根據(jù)?！舸坪税l(fā)育的意義

雌核發(fā)育具有產(chǎn)生單性種群的能力 迅速地產(chǎn)生同源型二倍體克隆 可通過(guò)克隆自交，即以激素致使性逆轉(zhuǎn)為雄性，再與同胞姐妹交配，獲得強(qiáng)壯的純系同型配子二倍體，然后籍助于雌核發(fā)育，產(chǎn)生新的純系來(lái)篩選除去有害的等位基因，以改良近新繁殖系（2）人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育的方法輻射處理：γ射線（通常用60Co或173Cs)，X射線和紫外線卵子遺傳物質(zhì)的失活，與正常精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間以冷、熱或高壓等處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育成為完全父本性狀的二倍體。染色體非整倍體變化◆個(gè)別染色體的削減和添加◆染色體代換多見(jiàn)于植物染色體工程（見(jiàn)教材235頁(yè)）（二）動(dòng)物染色體結(jié)構(gòu)的改造（p161）

◆人工染色體(artificialchromosome)

人工構(gòu)建的含有穩(wěn)定染色體的天然結(jié)構(gòu)序列，即ARS、CEN、TEL序列的微小染色體，可以象天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱為人工染色體。（三）人工染色體

大片段DNA克隆載體

人類和哺乳動(dòng)物的基因組很大，甚至許多單個(gè)基因也相當(dāng)大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來(lái)構(gòu)建的一些載體：BAC，YAC等。1、Yeastartificialchromosome

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）

篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）基本模式

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線EssentialCloningStepsYeastArtificialChromosome(YAC)構(gòu)建基因組文庫(kù)◆克隆文庫(kù)

（核酸探針）◆表達(dá)文庫(kù)

（免疫探針）用酵母人工染色體克隆基因時(shí)，尚存在三個(gè)問(wèn)題：⑴會(huì)發(fā)生嵌合體現(xiàn)象，即同一個(gè)酵母人工染色體中會(huì)有兩個(gè)不相連的DNA片段；⑵克隆的基因不穩(wěn)定，易發(fā)生缺失現(xiàn)象；⑶不能用簡(jiǎn)單的方法