《高級儀器分析技術》實驗一

食品與營養(yǎng)保健學院目錄實驗一：水的純度測定及電導率儀的使用實驗二：鐵的分光光度計法測定實驗三：瓊脂糖凝膠電泳實驗實驗四：高效液相色譜法測定茶葉中咖啡因水的純度測定及電導率儀的使用一、電導率儀的使用液體中的電流流動在固體導體中，電流是通過自由電子的移動而產生的。在液體導體中，電流是通過自由離子的移動而產生的。傳輸電流的離子物質被稱為電解液。電解液的實質是自由離子。分子水解產生帶正電的陽離子和帶負電的陰離子。電導率以數字表示溶液傳導電流的能力。在國際單位制中，電導率的單位稱為西門子每米〔S/m〕，其它單位有：mS/m，S/cm，μS/cm。1S/m=1000mS/m=1000000S/m=10mS/cm=10000μS/cm電阻率的倒數為電導率，用希臘字母κ表示，κ=1/ρ。除非特別指明，電導率的測量溫度是標準溫度〔25°C〕物理意義電導率是表示物質導電的性能。電導率越大那么導電性能越強，反之越小。另外：電導是電阻的倒數，電導率是電阻率的倒數。電導率是以數字表示溶液傳導電流的能力。水的電導率與其所含無機酸、堿、鹽的量有一定的關系，當它們的濃度較低時，電導率隨著濃度的增大而增加，因此，該指標常用于推測水中離子的總濃度或含鹽量。應用領域電廠-水處理；水廠和污水廠-廢水處理；造紙-生產過程/廢水處理；化工煉油-生產過程/廢水處理；冶金和采礦-生產過程/廢水處理；食品和飲料-生產過程/廢水處理；醫(yī)藥行業(yè)-生物反響和發(fā)酵/廢水處理；半導體-生產過程/廢水處理/高純水生產。測量原理-電導式測量原理將相互平行且距離是固定值L的兩塊極板〔或圓柱電極〕，放到被測溶液中，在極板的兩端加上一定的電勢。然后通過電導儀測量極板間電導。電導率的測量需要兩方面信息。一個是溶液的電導G，另一個是溶液的幾何參數S。電導可以通過電流、電壓的測量得到。根據關系式S=κ×G可以等到電導率的數值。測量原理歐姆定律:I=U/R=U×GG=電導[S=1/]溶液電導率C[mS/cm,μS/cm]:C=G×d/A其中：d為極板間距，A為極板面積又電極常數κ=d/A[cm-1]那么C=G×κ溶液電導率C只與溶液特性有關而與測量傳感器幾何尺寸無關。電導率儀電導率測定儀是一款多量程儀器，能夠滿足從去離子水到海水等多種應用檢測要求。儀器能夠提供溫度補償，并能設置溫度系數，因此能夠用于測量溫度系數與水不同的液體樣品。儀器測量原理電導率儀由振蕩器、放大器和指示器等局部組成。電導率儀的工作原理如下圖。

E為振蕩器產生的交流電壓，Rx為電導池的等效電阻，Rm為分壓電阻，Em為Rm上的交流分壓。由歐姆定律可知：

Kcell為電導池常數，當E、Rm和Kcell均為常數時，由電導率κ的變化必將引起Em作相應變化，所以測量Em的大小，也就測得溶液電導率的數值。。將Em送至交流放大器放大，再經過訊號整流，以獲得推動表頭的直流訊號輸出，表頭直讀電導率。1.振蕩器；2.電導池；3.放大器；4.指示器。影響因素溫度：電導率與溫度具有很大相關性。金屬的電導率隨著溫度的增高而降低。半導體的電導率隨著溫度的增高而增高。在一段溫度值域內，電導率可以被近似為與溫度成正比。為了要比較物質在不同溫度狀況的電導率，必須設定一個共同的參考溫度。電導率與溫度的相關性，時?？梢员磉_為，電導率對上溫度線圖的斜率。摻雜程度：固態(tài)半導體的摻雜程度會造成電導率很大的變化。增加摻雜程度會造成高電導率。水溶液的電導率上下相依于其內含溶質鹽的濃度，或其它會分解為電解質的化學雜質。水樣本的電導率是測量水的含鹽成分、含離子成分、含雜質成分等等的重要指標。水越純潔，電導率越低〔電阻率越高〕。水的電導率時常以電導系數來紀錄；電導系數是水在25°C溫度的電導率。電導率測量為什么需要溫度補償?離子的遷移速度與溫度有關物質的離解程度與溫度有關

T=

ref(1+

(T-Tref))withtemperaturecoefficient:

=(

T-ref)/[

ref(T-Tref)]

ref=conductivityatreferenceemperature(e.g.25°C)

T=conductivityat

processtemperatureTref=referencetempera

ture(e.g.25°C)T

=processtemperature電導率測量是與溫度相關的。溫度對電導率的影響程度依溶液的不同而不同，可以用下面的公式求得：Gt=Gtcal{1+α(T-Tcal)}其中：Gt=某一溫度〔°C〕下的電導率Gtcal=標準溫度〔°C〕下的電導率Tcal=溫度修正值α=標準溫度〔°C〕下溶液的溫度系數?！睤DS-11C型對被測液能作標準溫度系數2%〕下表列出了常用溶液的α值。要得到其他溶液的α值，只要測量某個溫度范圍內的電導率，并以溫度為縱軸繪出相應的電導率的變化曲線，與標準溫度相對應的曲線點為該溶液的α值。使用方法開機：按下電源開關，預熱30min。測量：〔1〕調節(jié)“常數〞補償旋鈕使顯示值與電極上所標常數值一致。〔2〕調節(jié)“溫度〞補償旋鈕至待測溶液實際溫度值。〔3〕先用蒸餾水清洗電極，濾紙吸干，再用被測溶液清洗一次，把電極浸入被測溶液中，用玻璃棒攪拌溶液，使溶液均勻，讀出溶液的電導率值。在測量過程中，假設顯示屏首位為1〔溢出〕，這表示被測溶液的電導率值超出量程范圍，此時應將【RANGE】旋鈕旋到高一檔進行測量，或者將樣品稀釋一定倍數進行測量。結束：用蒸餾水清洗電極；關機。電極常數選擇電導率范圍及對應電極常數推薦表校正方法精確配置標準溶液；調節(jié)標準溶液溫度至參照標準溫度〔一般為25℃〕，即25±0.1℃。按下式計算常數J：J=K/K測式中K為溶液標準電導率〔查下表可得〕測量標準液電導率、計算并修改常數數值。測量標準液電導率用以驗證。維護保養(yǎng)及本卷須知儀器內置的溫度系數為2%/℃，與此溫度系數不符的溶液使用溫度補償將會有誤差。因此，進行高精度測量或檢測高純水時，應采用無溫度補償方式進行，然后查表，或者將被測溶液恒溫在25℃，求其在25℃時的電導率值。為保證測量精度，電極使用前應用于小0.5μS/cm的去離子水〔或蒸餾水〕沖洗二次，然后用被測試樣沖洗前方可測量。出現異常情況，聯系管理員。測量時應采用配套使用的，不要采用其它型號的。測量低電導值的溶液時，請先在超純水中清晰并浸泡2個小時以上。測量過程中，從甲溶液轉到乙溶液時，先用蒸餾水清洗后，在用乙溶液清洗，不能用濾紙擦拭。電極使用完畢后應該清洗干凈，甩干后妥善保存〔可浸泡在純水中保存〕，防止碰撞損壞。防止電極的插頭和引線潮濕，否那么將會出現測量誤差。電極長期使用，電極常數會發(fā)生變化，影響測量準確性，此時應重新標定電極常數。電導電極的貯存與清洗電導電極的清洗1.可以用含有洗滌劑的溫水清洗電極上有機成分污垢，也可以用酒精清洗。2.鈣、鎂沉淀物最好用10℅檸檬酸。3.鍍鉑黑的電極，只能用化學方法清洗，用軟刷子機械清洗時會破壞鍍在電極外表的鍍層〔鉑黑〕。注意：某些化學方法清洗可能在生活破壞被輕度污染的鉑黑層。4.光亮的鉑電極，可以用軟刷子機械清洗。但在電極外表不可以產生裂痕，絕對不可以使用螺絲起子之類硬物清理電極外表，甚至在用軟刷子清洗時也要特別注意。電導電極的貯存電極〔長期不用〕應貯存在枯燥的地方。電極使用前必須放入〔貯存〕在蒸餾水中數小時，經常使用的電極可以放入〔貯存〕在蒸餾水中。二、水的純度測定實驗目的1.理解電導率儀的工作原理，掌握其使用方法。2.測定各種水體的純度。實驗原理

水的純度取決于水中可溶性電解質的含量。由于一般水中含有極其微量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、CO32–、Cl–、SO42–等多種離子，所以，具有導電能力。離子濃度愈大，導電能力越強，電導率越大；反之，水的純度越高，離子濃度愈小，電導率越小。因此通過測定電導率可以鑒定水的純度。實驗數據測量25℃、40℃、60℃的5種水樣的電導率并記錄。思考與討論溫度對電導率測定值有何影響？為什么？各種水樣的純度如何？應該如何選用？鐵的分光光度計法測定一、722型分光光度計的使用1．儀器性能的檢查〔1〕預熱：接通電源，讓儀器預熱至少二十分鐘，使儀器進入熱穩(wěn)定工作狀態(tài)。〔2〕調零：儀器接通電源后，即進入自檢狀態(tài)。顯示器實時顯示儀器的自檢狀態(tài)。當儀器發(fā)生故障時，顯示器會自動顯示故障位置。自檢結束，儀器自動尋找光源最大能量，查找完畢，儀器自動停留在420nm處，并自動調100%T和0%T。顯示器上顯示420nm和“100.0%T〞。儀器此時進入測試狀態(tài)。2．使用方法〔1〕按“方式鍵〞〔Mode〕將測試方式設置為吸光度方式?！?〕調節(jié)波長設置想要的分析波長420nm。〔3〕將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中。注意比色皿內的溶液面高度不應低于25毫米，大約2.5毫升；被測試的樣品中不能有氣泡和漂浮物。

〔4〕翻開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋。注意：一般情況下，參比樣品放在樣品架的第一個槽位中；儀器所附的比色皿，其透視率是經過測試匹配的，未經匹配處理的比色皿將影響樣品的測試精度；比色皿的透光局部外表不能有指印和溶液痕跡?！?〕將參比溶液推入光路中，按“100%T〞鍵調整零吸光度?！?〕將被測溶液推或拉入光路中，此時，顯示器上所顯示的是被測樣品的吸光度數值。二、磺基水楊酸顯色法

測定鐵實驗目的

1.掌握用磺基水楊酸顯色法測定鐵的原理和方法。

2.掌握722型分光光度計的使用方法。實驗原理

伯朗－比爾定律ε是摩爾吸光系數，其大小與入射光波長、溶液的性質、溫度等有關。假設入射光波長、比色皿〔溶液〕的厚度d一定時，吸光度只與溶液的濃度c成正比。本實驗選用磺基水楊酸〔簡寫為H3R〕與Fe3+形成的配位平衡體系，H3R和Fe3+等試劑與配合物的吸收光譜不重合，因此可用分光光度法測定。因溶液pH的不同，形成配合物的組成也不同。2.等摩爾系列法求配合物組成及穩(wěn)定常數在pH9~11.5的NH3·H2O-NH4Cl溶液中，Fe3+與磺基水楊酸反響生成三磺基水楊酸鐵黃色配合物。該配合物很穩(wěn)定,試劑用量及溶液酸度略有改變都無影響。Ca2+、Mg2+、Al3+等與磺基水楊酸能生成無色配合物,在顯色劑過量時,不干擾測定。F-、NO3-、PO43-等離子對測定無影響。Cu2+、Co2+、Ni2+、Cr3+等離子大量存在時干擾測定。由于Fe2+在堿性溶液中易被氧化，所以。本法所測定的鐵實際上是溶液中鐵的總含量?；腔畻钏徼F配合物在堿性溶液中的最大吸收波長為420nm,故在此波長下測量吸光度。實驗原理1.工作曲線的繪制在6只50mL容量瓶中,用吸量管分別參加0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL濃度為0.1mg/L的鐵鹽標準溶液，各加4mL10%NH4Cl溶液和2mL20%磺基水楊酸溶液,滴加氨水(1+1)直到溶液變黃色后,再多加1mL,加水稀釋至刻度,搖勻?！灿肗H3-NH4Cl作為緩沖溶液〕注意：A.在用磺基水楊酸鐵測定Fe3+時，在pH=10時形成的配合物穩(wěn)定，且不容易受干擾，所以在pH9-11.5下測定黃色3：1配位比的產物，pH對實驗成敗很關鍵，用NH3-NH4Cl作為緩沖溶液。B.用移液管移取試劑，注意順序，并且不能混用移液管。C.比色皿的使用中，每改變一次試液濃度，比色皿都要洗干凈。應該按照濃度從低到高測量，以減少影響。用分光光度計于420nm波長下,以試劑空白作參比溶液,調節(jié)透光度為100%,測出各標準溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標,鐵含量為橫坐標,繪制工作曲線。表1作工作曲線所配的系列溶液2.試液中鐵含量的測定用吸量管加待測試液5.00mL于50mL容量瓶中,在與標準溶液相同條件,按上述方法顯色,測量其吸光度。從工作曲線中查得相應的鐵含量,計算原試液中鐵的含量。注意：待測溶液一定要在工作曲線線形范圍內，如果濃度超出直線的線形范圍，那么有可能偏離朗伯-比耳定律是光吸收的根本定律，就不能使用吸光光度法測定。實驗結果表2標準曲線法數據記錄及結果根據記錄結果以吸光度為縱坐標,鐵含量為橫坐標,繪制工作曲線，從工作曲線上查出原試液中鐵的含量〔〕mg/L。標準溶液是否要準確移??？加NH4Cl的作用是什么？為什么要用氨水滴至溶液呈黃色？實驗中假設〔1〕每個溶液的濃度都不一樣〔2〕溫度有較大的變化〔3〕比色皿的透光面不潔凈將對測定穩(wěn)定常數有何影響？思考與討論瓊脂糖凝膠電泳實驗一、瓊脂糖凝膠電泳原理做瓊脂糖凝膠電泳的目的檢測所提取的DNA時檢驗PCR產物觀察限制性內切酶的切割結果切膠回收純化某個片段瓊脂糖凝膠電泳：實驗原理瓊脂糖是由瓊脂別離制備的鏈狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。其本身不帶有電荷。因此該凝膠適合于免疫復合物、核酸與核蛋白的別離、鑒定及純化。DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。凝膠電泳不僅可別離不同相對分子質量的DNA，也可以別離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。瓊脂糖凝膠電泳特點瓊脂糖凝膠的配制1.

根據電泳需要，配置適宜濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為1×TAE或0.5×TBE。

注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。2.

根據制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，參加準確稱量的瓊脂糖粉。注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量3.在微波爐中加熱溶解瓊脂糖

注意：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否那么，會造成電泳圖像模糊不清。加熱時如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時間不宜過長。4.

使溶液冷卻至60℃左右，如需要可在此時參加溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻——不提倡使用。

注意：溴化乙錠是一種致癌物質。使用含有溴化乙錠的溶液時，請戴用手套。溴化乙錠在可見光下會分解。5.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3－5mm之間。注意：不要產生氣泡，溶液溫度太高(>60℃)，會使得水分過分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。6.在室溫下使膠凝固〔大約30分鐘〕，然后放置于電泳槽中進行電泳。

注意：凝膠不立即使用時，用保鮮膜將凝膠包好在4℃下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存2～5天。瓊脂糖凝膠緩沖液Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液〔pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液〕Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE)Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE)瓊脂糖凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液是上樣時與樣品一起參加泳道的。載樣緩沖液有三個作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內；使樣品帶有顏色便于上樣操作；其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。上樣緩沖液有幾種，但根本都包括溴酚藍和二甲苯氰FF。溴酚藍在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無關；在0.5×TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍的速率約與長約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中根本不會變化。影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小凝膠的濃度DNA的構象使用的電壓瓊脂糖的種類電泳緩沖液嵌入染料的存在DNA分子的大小DNA分子大小遷移速率U與logN成反比〔N為堿基對數目〕。分子越大，摩擦阻力越大，同時大分子通過凝膠孔徑的效率也低于較小的分子，所以分子大的遷移慢。等量的空間結構，緊密的電泳快〔超螺旋>線性DNA〕一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，那么其電泳遷移速度越快。凝膠的濃度簡言之，濃度越大，分子孔徑就越小，DNA遷移速率就越低，反之遷移速率就大。另外，濃度也跟凝膠的分辨率有關，濃度越大，分辨率越高，但別離的ＤＮＡ片段就越小。DNA的構象一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。使用的電壓低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5-8V/cmDNA電泳常見問題分析二、瓊脂糖凝膠電泳操作不同電泳儀及水平電泳槽水平電泳槽和梳子

梳子的作用是制膠時插入膠中，以便膠凝固后產生加樣孔。伯樂公司〔bio-rad〕電泳儀凝膠/電泳槽凝膠成像系統制膠①配制5×〔或10×〕TBE或TAE或TPE貯存液，分別代表Tris-硼酸、Tris-乙酸、Tris-磷酸緩沖液②TBE的工作濃度一般為0.5×，電泳前將貯存液稀釋至工作濃度。配制凝膠用的TBE和電泳緩沖液應濃度一致。③稱取適宜重量的瓊脂糖，以便配制成一定濃度的凝膠。如稱取2g瓊脂糖加在100ml0.5×TBE中將制成濃度為2％的瓊脂糖凝膠。凝膠濃度越大，剛性越大，一般分辨能力也越強。常用的凝膠濃度在1％～2％之間，凝膠濃度太小那么凝膠容易太軟而且易碎，不好操作，但有時候確實需要較小濃度的凝膠。④膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。⑤將配制好的適當濃度的凝膠放入微波爐中融解，2分鐘左右即可，需嚴密觀察，小心操作，戴上微波爐專用手套，隨時輕輕搖動以便瓊脂糖完全融解，均勻分布?！仓敺罓C傷〕⑥參加EB〔可選〕：向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中參加溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/mL。〔貯存液10mg/ml〕⑦倒膠：用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。⑧拔梳：待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內參加0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上外表。上樣、電泳加樣：取10μLDNA樣品與2μL6×上樣液混勻，用微量移液槍小心參加樣品槽中。假設DNA含量偏低，那么可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，防止損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V〔1～5v/cm〕，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。結果觀察

觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。思考與討論DNA在電泳槽中泳動的原理？DNA遷移率的影響因素有哪些？高效液相色譜法測定茶葉中咖啡因一、高效液相色譜法根底〔一〕有機酸分析系統流程圖2348756

9101

1、2泵3進樣器4柱溫箱5電導檢測器6數據處理機7混合室8柱子9流動相10緩沖液分析條件別離條件色譜柱：Shim-packSCR-102H(8mmI.D．×300mmL.)1個或2個分析柱連接保護柱SCR-102H(6mmI.D.×50mmL.)流動相：5mMp-甲苯亞磺酸水溶液流量：0.8mL/min溫度：40℃或45℃檢測條件緩沖液：20mMBis-tris水溶液含5mMp-甲苯亞磺酸和100μＭEDTA流量：0.8mL/min檢測器：電導檢測器polarity;+樣品的分析實例食品啤酒，清酒，葡萄酒，醬油等體液血清，尿等醫(yī)藥品腎的透析液，鈣制劑等發(fā)酵微生物培養(yǎng)液，酸奶等環(huán)境工廠廢水等有機酸標準品的色譜圖1一個分析柱

1.磷酸

2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸啤酒的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸10.碳酸前處理振蕩除去碳酸氣后，過濾10μＬ進樣清酒的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.乙酸8.焦谷氨酸前處理過濾后，進樣10μＬmin.葡萄酒的色譜圖

1.磷酸

2.檸檬酸3.酒石酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸前處理用水稀釋10倍后過濾進樣量10μＬ

min.

醬油的色譜圖

1.磷酸

2.檸酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸前處理用水稀釋10倍后過濾進樣量10μＬ血清的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸7.焦谷氨酸8.未知物前處理加高氯酸用離心法去沉淀物，取上清液5uL進樣尿樣的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.乳酸4.甲酸5.未知物6.焦谷氨酸7未知物前處理過濾后，進樣10μＬ酸奶的色譜圖

1.磷酸

2.檸檬酸3.琥珀酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸前處理用水稀釋10倍后過濾進樣量10μＬ工廠廢水的色譜圖1.甲酸2.乙酸3.丙酸4.碳酸5.丁酸6.戊酸前處理過濾后，進樣10μＬ〔二〕氨基酸分析系統氨基酸衍生化方法柱后衍生柱前衍生氨基酸衍生化后的氨基酸試劑色譜柱檢測器色譜柱檢測器

氨基酸試劑色譜柱檢測器柱后衍生色譜柱:陽離子交換柱試劑:茚三酮方法---UV/VIS檢測器

OPA方法---熒光檢測器

氨基酸衍生化色譜柱檢察器柱前衍生異硫氰酸苯脂〔PITC〕Column:ReveredPhaseColumn(ODS)Reagent: OPA(Fluorescence) FMOC(Fluorescence) Fluorescamine(Fluorescence) DANS-Cl(Fluorescence)

PITC(UV)柱前衍生步驟〔三〕液相色譜常見問題及故障排除經驗液相系統維護流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器手動進樣器檢測器色譜柱等度系統儲液瓶脫氣機泵單元手動進樣器色譜柱檢測器廢液瓶1234567儲液瓶脫氣機泵單元自動進樣器色譜柱檢測器廢液瓶低壓梯度單元混合器低壓梯度系統123456789儲液瓶脫氣機泵單元自動進樣器色譜柱檢測器廢液瓶混合器高壓梯度系統12345678液相色譜故障排除經驗故障確實定—至少要重復出現兩次以上初步判斷故障引起的原因—方法或硬件由經驗或平時的積累確定故障原因—平時做好觀察和記錄當不能確認故障原因時—采用排除法逐一考察可能引起故障的因素確定故障能否自行處理—不要貿然拆卸不熟悉的部件常見故障因素儀器環(huán)境：—實驗室的溫度、濕度、酸度等—實驗室震動、灰塵等問題—電源及地線問題使用條件：—流動相〔pH值、均勻度、氣泡等〕—樣品〔樣品分解、氧化、樣品溶劑等〕—色譜柱〔污染、堵塞、塌陷等〕硬件問題：—輸液泵—進樣器—檢測器平常保養(yǎng)做好平常的保養(yǎng)可以有效的降低故障的發(fā)生率做好平常的保養(yǎng)可以延長儀器的使用壽命常做的保養(yǎng)—保證儀器的使用環(huán)境〔經常清潔儀器，尤其是灰塵〕—泵的保養(yǎng)〔使用緩沖鹽時要清洗柱塞，水和鹽不要長期保存在泵里〕—進樣器要經常清洗，防止污染物吸附或堵塞管路—盡量進行樣品前處理—色譜柱要定期清洗，保證柱效及使用壽命—系統中不要長期保存水和鹽，長時間不用時應將儀器所有局部全部更換為70％以上的甲醇，防止細菌的滋生及鹽的析出。液相色譜常見問題壓力異?！财?、波動〕漏液保存時間漂移基線問題〔漂移、噪聲〕峰形異常壓力是液相色譜中最重要的指標，要經常關注壓力的變化。保存時間的變化經常是由于壓力問題引起的。不同溶劑即使在相同流速和溫度的情況下壓力也是不同的。記下儀器正常狀態(tài)時，在固定條件下〔流動相、流速、溫度等〕的壓力顯示值。壓力過高時首先要確認是色譜柱堵塞還是系統堵塞色譜柱堵時，確認可能造成堵塞的樣品的性質，相應選擇適宜的清洗溶劑。系統堵塞，首先應確認是哪一部份堵塞，依據情況由后向前進行排除。容易發(fā)生堵塞的部件保護柱及色譜柱線路過濾器混合器過濾組件管路連接處進樣器檢測器流通池壓力過低如果壓力為零：泵頭中沒有液體，充滿氣泡單向閥完全堵死泵的柱塞桿折斷壓力傳感器損壞(流動相流動正常，但無壓力)如果有壓力但是壓力比正常時低：漏液單向閥堵塞壓力波動壓力在短時間內劇烈波動。泵頭中有氣泡單向閥臟柱塞密封圈漏液經常漏液的部件泵：柱塞密封圈,排液閥手動進樣器：轉子密封圈磨損檢測器：流通池窗口〔墊片損壞、透鏡破碎〕接頭處漏液：〔接頭松動，接頭臟，接頭磨損，部件不匹配〕保存時間不穩(wěn)定吸濾頭臟泵輸液不正?！矇毫Σ▌印馀莸取沉鲃酉嘟M分變化流動相緩沖能力不夠色譜柱平衡時間不夠柱溫的變化柱子問題噪音大流動相污染、變質或由低品質溶劑配成漏液流動相、泵、檢測器流通池內有氣泡流動相各溶劑不相溶或混和不均勻檢測池能量缺乏流通池被污染溫度影響〔檢測器和柱溫差異太大〕其他電子設備的影響或電源、地線等基線漂移流動相污染，變質或由低品質溶劑配成流動相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑)溫度波動系統平衡時間不夠流通池被污染或有氣泡流通池窗口破裂峰形問題死體積太大柱子被污染或堵塞色譜柱塌陷流動相緩沖缺乏或不適宜樣品溶劑選擇不當，與流動相之間極性差異太大樣品過載〔濃度或體積〕柱溫過低鬼峰流動相被污染進樣閥剩余峰樣品中未知物色譜柱中的污染物死體積死體積可能會引起別離度變差和重現性變差等問題.管線公螺母死體積好的連接差的連接選擇原那么采用“HPLC〞級溶劑防止使用會引起柱效損失或保存特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配流動相水/甲醇梯度ODS柱鬼峰鬼峰的出現流動相水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物吸光率流動相流動相的更換不互溶的流動相不能直接更換緩沖鹽不能直接用有機溶劑更換水正己烷異丙醇緩沖鹽有機溶劑水過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，防止堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液時。溶劑前處理色譜柱的日常保養(yǎng)購置新柱后一定要仔細閱讀說明書，確認柱的使用條件以及清洗再生步驟，按照說明書條件測試色譜柱柱效，記錄使用壓力定期檢測柱壓和柱效不同流動相之間轉換時應注意溶劑的互溶性確認樣品不會在流動相中析出或帶有固體不溶物，請使用0.45um或0.2um的一次性濾膜過濾樣品，或者進行前處理。為了延長色譜柱使用壽命，請使用保護柱。定期用適宜的溶劑清洗或再生色譜柱長期不用時，清洗干凈后，使用柱子說明書中指明的溶劑保存。柱子要從儀器上卸下并用堵頭密封后保存。定期用適宜的流動相清洗保存的柱子，防止干涸。二、高效液相色譜法測定茶葉中咖啡因實驗目的了解高效液相色譜法測定咖啡因的根本原理掌握高效液相色譜儀的操作掌握高效液相色譜法進行定性及定量的根本方法掌握標準曲線定量法實驗原理咖啡因〔C8H10N4O2〕又名咖啡堿，屬甲基黃嘌呤化合物，具有提神醒腦等刺激中樞神經的作用，可溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶劑。樣品在堿性條件下，用乙醇抽提，采用反相液相色譜柱進行別離，以紫外檢測器進行檢測，以咖啡因標準系列溶液的色譜峰面積對其濃度作工作曲線，再根據樣品中的咖啡因面積，由工作曲線算出濃度?？Х纫蚪Y構式實驗步驟1.系統適用性實驗使用咖啡因對照品圖譜驗證系統適用性，由圖1所得理論塔板數為2501.6〔大于2000〕，理論塔板高度為0.099mm，別離度為6.25〔大于1.5〕，均符合藥典規(guī)定。拖尾因子為1.18〔大于1.05〕是拖尾峰。

圖1咖啡因對照品溶液圖譜2.色譜條件及溶液制備〔1〕色譜條件色譜柱〔TC-C18Agilent，4.6mm×250mm，5μm，大連依利特〕，流動相：甲醇-水〔29:71〕，測定波長：280nm(氘燈)，柱溫箱：40°C，流速：1mL/min，進樣體積：10μL?！?〕對照品儲藏液制備精密稱取枯燥至恒重的咖啡因對照品0.5mg于10mL容量瓶中，加甲醇定容，制成1mL含咖啡因50μg/mL