《化妝品緊致功效體外測試方法 斑馬魚I型膠原蛋白和彈性蛋白基因測試》（征求意見稿）

SN/T××××—200×化妝品緊致功效體外測試方法斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白基因測試范圍本文件描述了化妝品緊致功效的體外測試方法-斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白基因表達測試方法。本文件適用于通過促進Ⅰ型膠原蛋白和/或彈性蛋白再生而達到緊致效果的化妝品功效評價?；瘖y品原料的緊致功效測試可參考本文件。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和測試方法GB/T39649實驗動物實驗魚質(zhì)量控制DB32/T3979實驗用斑馬魚飼育技術(shù)條件T/OTOP1038斑馬魚實驗室建設技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。基本原理緊致是指有助于保持皮膚的緊實度、彈性。在日常生活中，日照、化合物刺激等多種外部原因加上人體自身的內(nèi)部衰老，導致皮膚中膠原蛋白和彈性蛋白等皮膚基質(zhì)損傷流失，從而失去彈性。膠原蛋白是人體細胞外基質(zhì)中含量最高的蛋白，其中I型膠原蛋白是皮膚中最豐富的蛋白質(zhì)，約占成人皮膚膠原蛋白總量的85%，其含量決定了皮膚的密實度。彈性蛋白是人體皮膚中一種讓體內(nèi)許多組織在拉伸和收縮后維持原有形狀，讓皮膚在被擠壓后恢復到本來形狀的蛋白質(zhì)，對維持皮膚彈性起著重要作用。斑馬魚皮膚和人體皮膚相比，除表皮為分化了的表皮細胞和黏液層而非角質(zhì)層外，其余結(jié)構(gòu)和人體皮膚高度相似。斑馬魚的I型膠原蛋白分布與人體相同，I型膠原蛋白和彈性蛋白都顯示出與人類的高度保守性，兩者的內(nèi)源基因表達水平都在受精后4天內(nèi)一直升高，然后下降,6天至8天時相對平穩(wěn)。本方法應用6天大的斑馬魚進行暴露實驗，通過測試受試物是否促進斑馬魚I型膠原蛋白基因（col1a1a，col1a1b和col1a2）和/或彈性蛋白基因（elna）的表達，評價受試物促進I型膠原蛋白和/或彈性蛋白再生以增加皮膚緊實度和/或彈性的緊致功效。儀器和設備5.1分析天平：精度0.1mg。5.224孔板：玻璃或聚苯乙烯材質(zhì)。5.3生化培養(yǎng)箱：精度±1℃。5.4微量勻質(zhì)機。5.5高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速>17,000×g。5.6超微量紫外分光光度計：波長范圍包含230nm，260nm和280nm。5.7PCR擴增儀。5.8微孔板離心機。5.9qPCR儀。5.10其他常規(guī)儀器和設備：旋渦混合儀、移液器、低溫冰箱、超低溫冰箱。試劑及其制備6.1水：符合GB/T6682規(guī)定的實驗室用水。6.2無DNase/RNase超純水：建議采用商業(yè)制備的水。6.3冰。6.4助溶劑：甲醇、二甲基亞砜，分析純。6.5斑馬魚培養(yǎng)液：適合斑馬魚養(yǎng)殖的培養(yǎng)液，配置方法可參見附錄A。6.6乙?；?8溶液：用分析天平稱取8.0mg乙?；?8（純度≥98%）溶于10.0mL斑馬魚培養(yǎng)液中配制0.8mg/mL的乙酰基六肽-8溶液，使用前新鮮配制。6.7磷酸鹽緩沖液（PBS）：含1.54mmol/L磷酸二氫鉀、155.17mmol/L氯化鈉和2.71mmol/L磷酸氫鈉，pH7.2的溶液，建議采用商業(yè)10XPBS溶液。6.8RNAlater溶液：建議采用商業(yè)試劑。6.9mRNA提取試劑：建議采用商業(yè)試劑，如TRIzol試劑。6.10三氯甲烷：分析純級別。6.11異丙醇：分析純級別，（-20±2）℃凍存。6.1275%乙醇：用移液器取37.5mL無水乙醇溶于12.5mL無DNase/RNase超純水，（-20±2）℃凍存。6.13cDNA合成試劑：含gDNAEraser的PrimerScriptRT試劑盒，建議采用商業(yè)試劑盒。6.14qPCR反應試劑：建議采用和實時PCR儀信號檢測相匹配商業(yè)試劑盒。6.15qPCR反應板及相應光學密封膜：一般用96孔板或384孔板，孔板選擇需和對應的熒光qPCR儀及密封膜相匹配。6.16基因引物信息：基因引物信息見表1。表1基因引物信息表基因引物序列管家基因β-actin上游引物GCTGACAGGATGCAGAAGGA下游引物TAGAAGCATTTGCGGTGGACI型膠原蛋白基因col1a1a上游引物TAGCCCCTATGGACGTTGGT下游引物CGCAGGTCTAAGCAAGTGGAcol1a1b上游引物TGGCATGACCGGCCCTATTG下游引物CTCTCCTTTAGCACCAGGCTGTcol1a12上游引物GAGGCCAGCCTGGTAACATT下游引物GTTACCATCAGGACCAGGGC彈性蛋白基因elna上游引物AAAACCAGGTTACGGCTCTGT下游引物TCCTCCTGGATAAGCTCCGTATC受試生物準備斑馬魚品系選擇參考GB/T39649，飼養(yǎng)環(huán)境參考T/OTOP1038，斑馬魚魚卵采集及準備參考DB32/T3979。挑選健康的受精后（144±2）h斑馬魚進行試驗。受試物準備水溶性受試物，用斑馬魚培養(yǎng)液直接將受試物溶解，配制成測試溶液。非水溶性受試物，可選用甲醇、二甲基亞砜等助溶劑溶解，然后用斑馬魚培養(yǎng)液稀釋，配制成所需濃度的測試溶液。測試溶液中助溶劑濃度不要超過0.1%（v/v）。試驗方法9.1試驗流程試驗流程見附錄B。9.2試驗分組需設置空白對照組、陽性對照組和受試物組。如有用助溶劑，則每組中助溶劑濃度應一致。9.2.1空白對照組隨機挑選36尾斑馬魚平均分配到24孔板的3個孔中，每孔含12尾斑馬魚和2.5mL斑馬魚培養(yǎng)液。9.2.2陽性對照組隨機挑選36尾斑馬魚平均分配到24孔板的3個孔中，每孔含12尾斑馬魚和2.5mL含0.8mg/mL乙酰基六肽-8的斑馬魚培養(yǎng)液。9.2.3受試物組隨機挑選36尾斑馬魚，平均分配到24孔板的3個孔中，每孔含12尾斑馬魚和2.5mL含受試物的斑馬魚培養(yǎng)液。9.3暴露條件放置于（28±1）℃恒溫箱中培養(yǎng)（24±1）h。暴露結(jié)束時記錄每孔斑馬魚存活情況。收集存活率≥90%的孔中斑馬魚，除去溶液，加入0.5mLRNAlater溶液后于（-20±2）℃低溫冰箱凍存。9.4總RNA提取9.4.1TRIzol法除去RNAlater溶液，用PBS溶液沖洗斑馬魚3次。置于冰浴（含大量冰的水?。?，除去PBS溶液，加入500μL的TRIzol試劑。用微量勻質(zhì)機對斑馬魚進行均質(zhì)化處理，置于冰浴中10min。加入100μL三氯甲烷，旋渦混合儀中渦旋1min后置于冰浴中5min。于4℃的高速冷凍離心機中以17,000×g離心20min，轉(zhuǎn)移上層溶液至1.5mL離心管中，加入250μL異丙醇，旋渦混合儀中渦旋1min，置于冰浴中10min后于4℃的高速冷凍離心機中以17,000×g離心20min。除去上清液，加入500μL約4℃的75%乙醇，旋渦混合儀中渦旋1min后于4℃以17,000×g離心5min，重復此步驟3次。除去乙醇，將樣本于4℃的高速冷凍離心機中以17,000×g離心5min，打開蓋子風干樣品10min。加入10μL無DNase/RNase超純水，于（55±1）℃PCR儀中加熱15min。應用超微量紫外分光光度計對總RNA濃度進行測定，要求總RNA樣本在260nm、280nm和230nm處的吸光度，A260/A280應>1.8，A260/A230應在2.0-2.2之間。提取的總RNA樣本需在（-80±2）℃超低溫冰箱儲存，最好總RNA提取當日進行cDNA合成。9.4.2商業(yè)試劑盒法可采用其他商業(yè)試劑盒提取總RNA，具體操作按商業(yè)試劑盒指引進行。9.5cDNA合成根據(jù)cDNA合成試劑盒指引，取1000ng的總RNA樣本，和gDNAEraser溶液混合成10μL溶液，于PCR儀中42℃處理5min、然后加入10μL反轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖溶液混合液，于PCR儀中37℃反應15min、85℃處理5s后將反應溫度降至4℃。cDNA樣本需（-20±1）℃低溫冰箱中儲存。9.6qPCR檢測9.6.1嵌合熒光法每個基因相對表達量的檢測都需設置獨立的PCR反應體系。每個cDNA樣本的每個基因相對表達量的反應體系需設立至少3個重復。每個重復的PCR反應液由下列組份配置（反應液配置在冰上進行）。反應體系應設置在（10-25）μL范圍內(nèi)。反應體系可參見表2。表2熒光PCR反應體系第一步:試劑名稱加入量PremixExTaq12.5μLROX染料（50x）0.5μL無RNA/DNA酶的超純水6.75μLcDNA模板（<100ng）0.25μL總量20μL第二步:試劑名稱加入量上游引物（10μM）0.25μL下游引物（10μM）0.25μL無RNA/DNA酶的超純水4.5μL總量5μL將20μL第一步的混合液和5μL第二步的混合液混勻后，加入到96或384孔qPCR反應板中，用光學膠膜密封孔板，于4℃微孔板離心機中以1,000r/min離心5min，將孔板放入熒光定量PCR擴增儀進行擴增。qPCR擴增條件會因采用不同qPCR儀而有所不同，可參見表3程序進行。表3擴增程序熒光PCR溫度時間循環(huán)數(shù)95℃30s195℃5s4060℃30s熔解曲線溫度時間循環(huán)數(shù)95℃15s160℃1min95℃15s9.6.2商業(yè)試劑盒法也可采用其他商業(yè)試劑盒進行qPCR檢測，具體操作按商業(yè)試劑盒指引進行。9.7結(jié)果分析9.7.1基因相對表達促進倍數(shù)的計算收集qPCR測試結(jié)果數(shù)據(jù)。Ct（基因熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）作為擴增結(jié)果，以β-actin基因擴增量作為管家基因，計算每個基因（col1a1a,col1a1b,col1a2和Elna）的相對表達量。?Ct=Ct目的基因??Ct=ΔCt基因相對表達量=2???基因表達促進倍數(shù)=2式中：?Ct：目的基因的循環(huán)數(shù)與管家基因的循環(huán)數(shù)之差；Ct目的基因：目的基因Ctβ???Ct：空白對照組?Ct平均值和受試物組?CtΔCt空白對照組：空白對照組ΔCt受試物：受試物組2???Ct空白對照組：空白對照2???Ct受試物組：9.7.2統(tǒng)計學分析計算各測試組的平均值及標準誤，統(tǒng)計學處理結(jié)果用平均值±標準誤表示。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對受試物組和空白對照組間目的基因相對表達量進行雙尾T檢驗，取得P值。P<0.05表示有顯著性差異。試驗有效性驗證10.1各測試組暴露完成后存活率不低于90%，否則對應測試組結(jié)果無效。10.2每批次測試須設置陽性對照組，要求每批次測試中陽性對照組最少2個I型膠原蛋白基因和彈性蛋白基因相對表達量都顯著（P<0.05）高于空白對照組。試驗結(jié)論如受試物能顯著促進至少2個I型膠原蛋白基因和/或彈性蛋白基因表達，即基因表達促進倍數(shù)為正數(shù)且基因相對表達量具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），則判定受試物具有促進I型膠原蛋白基因和/或彈性蛋白基因表達的效果，可作為緊致功效的定性依據(jù)。試驗報告試驗報告至少應包括下列內(nèi)容：a)委托企業(yè)名稱、地址等相關(guān)信息；b)功效評價機構(gòu)名稱、地址等相關(guān)信息；c)識別被測樣品所需全部信息（包括試驗樣品的名稱、形狀、數(shù)量及規(guī)格、生產(chǎn)日期和保質(zhì)期或生產(chǎn)批號和限期使用日期、儲存條件等）；d)材料和方法：用到的受試生物和器材、方案概要、采用的統(tǒng)計方法等；e)試驗結(jié)果：根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果確定試驗產(chǎn)品是否具有緊致功效；f)報告的日期；g)技術(shù)負責人簽字及日期；H)出具報告企業(yè)蓋章。附錄A（規(guī)范性）斑馬魚培養(yǎng)液配制方法A.1表A.1規(guī)定了3種常用斑馬魚培養(yǎng)液配制方法。表A.13種常用斑馬魚培養(yǎng)液配置方法斑馬魚培養(yǎng)液配制方法斑馬魚培養(yǎng)液1稱取2940mg無水氯化鈣，1233mg七水硫酸鎂，630mg碳酸氫鈉，55mg氯化鉀溶于10L水配制而成。pH值6.5～8.5?；瘜W品均為分析純級別。斑馬魚培養(yǎng)液2稱取17.2g氯化鈉，0.76g氯化鉀，2.9g氯化鈣和4.9g硫酸鎂溶于水中定容至1000mL儲備液。取16.67mL儲備液用水稀釋至1000mL而成?；瘜W品均為分析純級別。斑馬魚培養(yǎng)液3稱取7.000g氯化鈉，0.400g碳酸氫鈉，0.100g氯化鉀，0.235g氯化鈣溶于2L水配制而成，化學品均為分析純級別。附錄B（規(guī)范性）試驗流程圖B.1圖B.1規(guī)定了試驗流程。圖B.1試驗流程圖參考文獻[1]國家藥監(jiān)局關(guān)于發(fā)布《化妝品分類規(guī)則和分類目錄》的公告（2021年第49號）[2]國家藥監(jiān)局關(guān)于發(fā)布《化妝品功效宣稱評價規(guī)范》的公告（2021年第50號）[3]ShinJW,KwonSH,ChoiJY,etal.Molecularmechanismsofdermalagingandanti-agingapproaches[J].IntJMolSci,2019,20(9):2126.[4]GistelinckC,GioiaR,GagliardiA,etal.ZebrafishcollagentypeI:Molecularandbiochemicalcharacterizationofthemajorstructuralprotein