《儀器分析》4-高效液相色譜法

第四章高效液相色譜法

HighPerformanceLiquidChromatography精選課件精選課件定義：以液體作為流動相的色譜法稱為液相色譜法高效液相色譜法（HPLC）：20世紀(jì)60年代末70年代技術(shù)：高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器特點：速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化一、概述4.1高效液相色譜法簡介精選課件1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較

⑴高速：HPLC分離效率高，速度快，一次幾分鐘和幾十分鐘就可完成。色譜柱的壽命長，可達兩年以上。⑵高效：HPLC高壓(2~6

MPa)下操作，填料顆粒小(2~50

m)，規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻力小，柱效高(N=4000~60000塊/m)，分離效率高。⑶高靈敏度：現(xiàn)代高效液相色譜儀普遍配有高靈敏度檢測器，使分析靈敏度比經(jīng)典色譜有大提高（紫外檢測器最小檢測限可達10-9g；熒光檢測器最小檢測限可達10-11~10-13g。⑷高自動化：HPLC進樣量小(x~x0

L)。帶有自動進樣裝置和工作站。精選課件2．高效液相色譜法與氣相色譜法的比較⑴適用范圍GC適用于沸點低、熱穩(wěn)定性好、中小分子量的化合物，HPLC不受此種限制。氣相色譜一般都在較高溫度下進行，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。⑵流動相GC流動相僅運載樣品，不起分離作用，但無毒，易于處理。而HPLC流動相除了運載樣品外，還有分離作用，可改變流動相組成，進行有效的分離。但流動相一般有毒，費用高。精選課件⑶色譜柱GC柱很長，特別是毛細管柱可長至幾十米至上百米，柱效很高(理論塔板數(shù)N=104~106)。HPLC柱較短，一般為15~25cm，柱效(理論塔板數(shù)N=103~104)，低于GC柱。⑷檢測器與GC相比，HPLC檢測器種類較多。⑸制備色譜GC難以制備樣品，因為進樣量小，難以收集或被破壞。HPLC可進行制備，即制備色譜。精選課件一﹑高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)4.2

高效液相色譜儀精選課件一般分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度洗脫、自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

精選課件數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)HPLC的系統(tǒng)組成數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)精選課件1.

高壓輸液系統(tǒng)：

一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。高壓泵應(yīng)滿足如下要求：流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。能抗溶劑的腐蝕，耐酸、耐堿。有較高的輸送壓力。一般分離，6.0×104Pa壓力；高效分離，要求達到1.5~3.0×107Pa的壓力或更高。④泵的死體積要小，便于迅速更換溶劑和進行梯度淋洗。精選課件常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種:㈠恒流泵是在一定操作條件下，輸出流量恒定，與色譜柱引起阻力變化無關(guān)。㈡恒壓泵能保持輸出壓力恒定，其流量隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，保留時間的重現(xiàn)性差。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵，恒流泵又稱機械泵，又分機械注射泵和機械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機械往復(fù)泵。精選課件精選課件梯度洗脫裝置在液相色譜中，改變流動相可以改善分離效果。因此在分離復(fù)雜混合物時，按照一定的程序連續(xù)改變流動相的組成，可提高分離效率和加快分析速度。梯度洗脫裝置就是為此目的而設(shè)置的一種裝置。梯度洗脫裝置有兩類：低壓梯度：常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂敵錾V柱；高壓梯度：將溶劑用高壓泵增壓后輸入色譜系統(tǒng)梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。

精選課件在分離過程中，使流動相的組成、極性、pH等按一定程序連續(xù)變化，使樣品中各組分能在最佳條件下出峰，保留時間短、擁擠不堪甚至重疊的組分和保留時間過長而峰形扁平的組分獲得很好的分離。通過逐漸改變流動相的組成增加洗脫能力，梯度洗脫裝置將兩種或三種、四種溶劑按一定比例混合進行二元或三元、四元梯度洗脫。精選課件梯度洗脫的優(yōu)點：①改善峰形；②提高柱效；③減少分析時間；使強烈滯留的組分不容易殘留在柱上，保持良好的柱性能（但進行下次分析時，更換流動相達到平衡時間長）。

梯度洗脫與氣相色譜的程序升溫十分類似，兩者的目的相同，不同的是程序升溫是通過改變柱溫，而液相色譜的梯度洗脫是通過改變流動相的組成、極性、pH來達到改變k的目的。精選課件在高效液相色譜中，常用的進樣方式：高壓閥進樣：優(yōu)點是能用于高壓，適于大體積進樣，重現(xiàn)性好；缺點是進樣閥進樣時需排掉一部分試樣，不同的進樣量需用不同的定量管，同時峰的擴展也比注射進樣大。微量注射器進樣：也可由微量注射器注入取樣環(huán)少量樣品，即采用較大體積取樣環(huán)而進少量試樣，進樣量由注射器控制，試樣不充滿取樣環(huán)，只填充一部分體積。2.進樣系統(tǒng)精選課件3.分離系統(tǒng)--色譜柱色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其它金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長15~30

cm，內(nèi)徑為4~5

mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3~12

mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達25

mm以上。精選課件⑴固定相①表面多孔固定相②全多孔微粒固定相直徑2~10

m，孔徑2~100nm，比表面積x0~x00m2/g。現(xiàn)在最廣泛采用的填料是全多孔微粒硅膠1~2

m直徑10~25

m精選課件③化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合相色譜柱雖然可將固定液機械地涂附在上述表面多孔硅膠或全多孔硅膠上作固定相，但有許多缺點，因此現(xiàn)在多采用化學(xué)鍵合固定相?；瘜W(xué)鍵合固定相是在表面多孔或全多孔硅膠表面上利用化學(xué)反應(yīng)法通過化學(xué)鍵把有機分子結(jié)合在載體表面。

鍵合類型：㈠疏水基團：如C8、C18；㈡極性基團：如丙氨基(-C3H6NH2)、氰乙基(-C2H4CN)；精選課件㈢離子交換基團，如陰離子交換（-NR3Cl）、陽離子（-SO3H）；鍵合途徑：①Si—O—C鍵型②Si—O—Si—C鍵型(最常用)③Si—C鍵型精選課件⑵流動相正相色譜極性：流動相﹤固定相反相色譜極性：流動相﹥固定相a流動相純度要高，與固定相不相溶，不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)b價格便宜，毒性小，易于純化c對試樣溶解度適宜，不發(fā)生沉淀d粘度小e與檢測器匹配極性順序：水﹥乙腈﹥甲醇﹥四氫呋喃﹥環(huán)己烷﹥煤油精選課件4.檢測系統(tǒng)

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器:⑴溶質(zhì)性檢測器：僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，有紫外UVD、熒光FD、二極管陣列檢測器DAD等。⑵總體檢測器：對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，有示差折光檢測器RID、電化學(xué)檢測器ECD、蒸發(fā)光散射檢測器ELSD和質(zhì)譜檢測器MSD等。

精選課件藥典中的液相色譜檢測器精選課件常用的檢測器:(1)紫外光度檢測器：是一種選擇性濃度檢測器，僅對那些在紫外波長有吸收的物質(zhì)有響應(yīng)。作用原理：基于待測試樣對特定波長的紫外光有選擇性的吸收，試樣濃度與吸光度的關(guān)系服從比爾定律。

結(jié)構(gòu)：1－低壓汞燈2－透鏡3－遮光板4－測量池5－參比池6－紫外濾光片7－雙紫外光敏電阻精選課件現(xiàn)在多數(shù)采用氘燈作為紫外光源燈流動池光電二極管RS樣品入口Hg254Zn214Cd229D2可變UV檢測器Toamplifier精選課件優(yōu)點：靈敏度高（最小檢測度10–9g/mL），對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫；缺點：只能用于對紫外光有吸收組分的測定，溶劑的選擇受限制。在高效液相色譜中應(yīng)用最廣，約占70%。適于梯度洗脫，對流動相速度變化不敏感，流動相組成的變化對檢測器響應(yīng)幾乎無影響。對于在紫外-可見光區(qū)無強吸收的組分，需要經(jīng)過衍生化，才可以用紫外檢測器，如糖類、氨基酸、類脂化物。不能用在紫外-可見光有吸收的溶劑作流動相。精選課件溶劑透過波長下限溶劑透過波長下限水180n-庚烷197甲醇210環(huán)乙胺200n-丙醇二酸205四氯化碳265乙腈190氯仿245THF230苯280丙酮330甲苯285乙酸甲酯260二氯甲烷232乙酸乙酯260四氯乙烯280硝基甲烷3801,2-二氯乙烷225常用溶劑透過波長限：精選課件(2)光二極管陣列檢測器：

是一種更為先進的檢測器。從氘燈輻射通過移動部件（光閘），直接通過吸收池、狹縫、光柵，分光后分別照射約千個二極管陣列檢測器上，約10ms給出一次信號，保證保留時間極短的色譜組分的光譜圖不失真。因此數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，靈敏度高，適于痕量分析。

氘燈

棱鏡池子全息光柵二極管陣列512Diodes190-950nm精選課件優(yōu)點：獲得吸收值是保留時間和波長函數(shù)的類似于等高線的三維圖；由于獲得多種信息，使每一個組分在整個波長范圍內(nèi)的光譜信息大大增加，及時得出每一組分的色譜圖相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，確定最佳選擇性和靈敏度的波長；可以與色譜工作站聯(lián)用，對每一個峰從程序庫中進行檢索來確定該化合物。精選課件例如：菲的三維譜圖如下精選課件⑶熒光檢測器：是利用某些試樣具有熒光特性來檢驗的。許多有機化合物具有天然熒光活性，其中帶有芳香基團的化合物具有熒光活性很強。一定條件下，熒光強度與物質(zhì)濃度成正比。熒光檢測器是一種選擇性檢測器，適合于含有π-π共軛體系的大分子、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，如稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、維生素、色素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的測定。最小檢測限可達10-11~10-13g，可以用梯度洗脫。精選課件(4)示差折光檢測器：是一種中等靈敏度(10–6g/mL)的通用型檢測器。是利用純流動相和含有待測組分的流動相之間折射率的差別進行檢測的?？煞譃槿悾悍瓷涫?；折射式（偏振式）和干涉式。常用前兩種。優(yōu)點：靈敏度適宜，操作簡便是一種通用型的檢測器；缺點：對溫度變化敏感，不能用于梯度洗脫。應(yīng)用范圍：聚合物、糖。還用于分析以紫外檢測和熒光檢測器無法檢測的樣品。精選課件(5)

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）①結(jié)構(gòu)精選課件

ELSD是90年代研制的，是利用在一定條件下粒子的數(shù)量不變，光散射強度正比于由溶質(zhì)濃度決定的粒子的大小而進行測量的。

ELSD原理是基于光線通過微小的粒子時產(chǎn)生光散射現(xiàn)象。由色譜柱分離的組分隨流動相進入霧化器中被高速的載氣流（氮氣或空氣）噴成一種薄霧，進入蒸發(fā)器后蒸發(fā)成蒸氣，再被光阱捕集，以防止反射。蒸氣態(tài)的溶劑通過光路后，光線反射到檢測器后被記錄成基線。云霧狀溶質(zhì)顆粒通過光路時，使光線散射后被光電倍增管收集得到樣品信號。

ELSD是示差折光檢測器的新型替代品，樣品主要用于不產(chǎn)生熒光和又無紫外吸收的有機物如糖類、高級脂肪酸、磷脂、甘油三酯、維生素、甾類皂苷等物質(zhì)的測定。對梯度洗脫和流動相系統(tǒng)溫度變化不敏感；可用于梯度洗脫。精選課件ELSD的優(yōu)缺點：⑴通用性強，靈敏度高。⑵對流動相系統(tǒng)溫度變化不敏感，可進行梯度洗脫。⑶響應(yīng)因子具有一致性。響應(yīng)值僅取決于光束中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量，檢測器對有的物質(zhì)幾乎具有相同的響應(yīng)因子。⑷可消除流動相和雜質(zhì)的干擾，提高分辯率。用于磷脂、皂甙、糖、聚合物、樹脂等無紫外吸收或紫外吸收系數(shù)小的化合物檢測。⑸便于應(yīng)用質(zhì)譜分析。因為蒸發(fā)光散射質(zhì)量檢測器與質(zhì)譜條件的要求是一致的。⑹受樣品組分和流動相揮發(fā)性因素限制。要求樣品組分應(yīng)是非揮發(fā)性或半揮發(fā)性的，而流動相應(yīng)是揮發(fā)性溶劑。⑺對某些樣品線性范圍窄，有時不呈現(xiàn)線性關(guān)系，定量分析復(fù)雜。精選課件⑹電化學(xué)檢測器：安培檢測器：由三電極系統(tǒng)與恒電位儀相連接。工作電極為玻璃或石墨電極，輔助電極是鉑絲；從柱后流出物進入反應(yīng)池，在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極之間有電流通過，電流大小與被測物濃度成正比。只能檢測電化學(xué)活性物質(zhì)。該檢測器選擇性好，靈敏度高。如：對腎上腺素和去甲腎上腺素，檢測限達10-12g。極譜檢測器：

基于被測組分可在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)而設(shè)計的一種檢測器?？捎糜跍y定具有極譜活性的物質(zhì)，如藥物、維生素、有機酸、苯胺等。它的靈敏度高，適于痕量分析。電導(dǎo)檢測器：主要用于離子色譜。原理是基于物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來測定電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測器對pH>7時不夠靈敏，受溫度影響較大。精選課件5.附屬系統(tǒng)

包括脫氣、梯度洗脫、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中脫氣和梯度洗脫裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。

脫氣的目的：是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出，釋放出氣泡進入檢測器而使噪聲劇增，甚至不能正常檢測；溶解在溶劑中的氣體進入色譜柱時，可能與流動相或固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；溶解氣體還會引起某樣品的氧化降解，帶來誤差。通常辦法是把氣泡排出。精選課件常用方法：①低壓脫氣，電磁攪拌，水泵