低直鏈淀粉基因的遺傳分析與基因定位

序號：編碼：第十一屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學生課外學術科技作品競賽作品申報書作品名稱：XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位學校全稱：華南農(nóng)業(yè)大學申報者姓名（集體名稱）：胡小梅鄧杏陳月柳彭景芳趙娟類別：■自然科學類學術論文 □哲學社會科學類社會調查報告和學術論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類

說明1．申報者應在認真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據(jù)個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學類學術論文、哲學社會科學類社會調查報告和學術論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報者可根據(jù)情況填寫C表。3．表內(nèi)項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復制。4．序號、編碼由第十一屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學生課外學術科技作品競賽組委會填寫。5．學術論文、社會調查報告及所附的有關材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上（文章版面尺寸14.5×22cm），附于申報書后，論文不超8000字，調查報告不超15000字。6．作品申報書須按要求由各校競賽組織協(xié)調機構統(tǒng)一寄送。7．其他參賽事宜請向本校競賽組織協(xié)調機構咨詢。A2申報者情況（集體項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫，申報者情況欄內(nèi)必須填寫個人作品的第一作者（承擔申報作品60%以上的工作者）；2．本表中的學籍管理部門簽章視為對申報者情況的確認。。申報者代表情況姓名胡小梅性別女出生年月1990年9月學院農(nóng)學院系別、專業(yè)、年級08農(nóng)業(yè)生物技術2班學歷在讀本科學制4入學時間2008年9月作品名稱XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位畢業(yè)論文題目無通訊地址廣州市華南農(nóng)業(yè)大學啟林南區(qū)39棟郵政編碼510642辦公電話常住地通訊地址廣州市華南農(nóng)業(yè)大學啟林南區(qū)39棟郵政編碼510642住宅電話其他作者情況姓名性別年齡學歷所在單位陳月柳女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院彭景芳女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院趙娟女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院鄧杏女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院資格認定學院學籍管理部門意見以上作者是否為2011年7月1日前□是□否（部門簽章）年月日院系負責人或導師意見本作品是否為課外學術科技或社會實踐活動成果□是□否負責人簽名：年月日

B1．申報作品情況（自然科學類學術論文）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫；2．申報者代表必須是作者中學歷最高者，其余作者按學歷高低排列；3．本表中的學籍管理部門簽章視為申報者情況的確認。作品全稱XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位（學術論文）作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．數(shù)理（包括數(shù)學、物理、地球與空間科學等）D．生命科學（包括生物、農(nóng)學、藥學、醫(yī)學、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路水稻是我國最重要的糧食作物，直鏈淀粉含量過高已成為制約南方早秈和雜交稻品質改良的關鍵因素之一，目前單一的Wx復等位基因已無法滿足秈稻品質改良需求，因此，發(fā)掘和創(chuàng)造秈型非Wx低直鏈淀粉水稻突變體，明確其遺傳機理和基因功能，具有重要的理論和實踐意義。前期研究表明，秈稻突變體XLA-1低直鏈淀粉性狀由非Wx低直鏈淀粉突變基因控制。本項目在前期研究基礎上,利用特異性功能引物鑒定XLA-1含有的突變基因與野生型Wx基因差異；運用遺傳學手段明確XLA-1低直鏈淀粉突變基因與Wx基因的互作關系，闡明其遺傳機理；利用分子生物學手段定位XLA-1低直鏈淀粉突變基因，并獲得與其緊密連鎖的分子標記，為水稻品質改良提供理論依據(jù)和種質材料。作品的科學性、先進性及獨特之處科學性：Wx基因編碼的顆粒結合淀粉合成酶（GBSS）是直鏈淀粉合成的關鍵酶，其具有一系列復等位基因，從而影響直鏈淀粉含量高低，是目前生產(chǎn)上利用的最主要的基因資源。在育種實踐上，由于直鏈淀粉性狀屬于三倍體遺傳，因此利用Wx復等位基因改良水稻直鏈淀粉含量難度較大。如在高AAC與低AAC的雜交后代中能出現(xiàn)中等AAC的個體，但這種個體的基因型是雜合的，后代還會出現(xiàn)繼續(xù)分離[9]，最終產(chǎn)生的是與親本AAC相似的純合體，育種選擇周期長、效果差。如果利用非Wx低直鏈淀粉基因資源，由于遺傳重組的存在，在雜交后代中可以較快得到中等直鏈淀粉含量的純合體。先進性：本實驗室利用空間誘變技術，經(jīng)過長期觀察篩選，已經(jīng)得到多個秈型低直鏈淀粉含量突變體，這些突變體的獲得為深入闡明水稻直鏈淀粉調控機理奠定了材料基礎。本項目通過突變體精細定位分離克隆控制水稻低直鏈淀粉相關基因或QTL，并獲得與其緊密連鎖的分子標記，項目研究成果不僅能為優(yōu)質水稻分子育種技術平臺提供有利的品質基因資源，而且可為深入理解秈稻直鏈淀粉調控機理提供理論依據(jù)。獨特之處：本研究所用材料為秈型非Wx低直鏈淀粉調控基因，目前國內(nèi)有關秈稻低直鏈淀粉研究報道較少。本研究不僅材料上具有創(chuàng)新性，而且對揭示秈稻直鏈淀粉性狀的調控及分子機理具有較大的理論意義。作品的實際應用價值和現(xiàn)實意義水稻是禾本科作物基因組研究的模式植物，目前在水稻中已經(jīng)報道的淀粉合成相關基因有20多個,但這些基因如何相互作用調控淀粉的含量與結構尚未明確發(fā)現(xiàn)，因此，非Wx低直鏈淀粉基因的精細定位和克隆對研究禾本科作物的淀粉合成機理和品質育種具有重要的意義?？筛鶕?jù)此結果育出穩(wěn)定遺傳的直鏈淀粉含量低的水稻品種，若用于生產(chǎn)則大大地解決了人們對于米飯口感品質的要求。也可將此基因克隆轉入其他品種來改善其品質或者利用常規(guī)育種將此基因順利導入其它高產(chǎn)優(yōu)質的水稻種育出更好的品種。學術論文文摘摘要：在前期研究基礎上，本研究以低直鏈淀粉突變體XLA-1為材料，利用SSR標記與作圖群體，在第6染色體上端定位了一個非Wx基因lac（暫命名），該基因位于SSR標記RM19288、RM19297之間，遺傳距離分別為5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通過與已定位的低直鏈淀粉突變基因位置比對，初步表明lac為一新的秈稻低直鏈淀粉含量基因。通過該基因的獲得，豐富了秈稻的低直鏈淀粉基因資源，也為該基因的精細定位和圖位克隆研究打下了良好的基礎作品在何時、何地、何種機構舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵獲2011年華南農(nóng)業(yè)大學“丁穎杯”課外學術科技作品競賽二等獎鑒定結果（1）明確XLA-1低直鏈淀粉突變特性遺傳機理；（2）將秈型非Wx低直鏈淀粉突變基因lac定位于兩個分子標記間，遺傳距離均小于5cM。請?zhí)峁τ诶斫狻彶?、評價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術及技術文獻的檢索目錄[1]胡培松,翟虎渠,萬建民,等.中國水稻生產(chǎn)新特點與稻米品質改良.中國農(nóng)業(yè)科技導報,2002,4(4):33-39.[2]I.Mikami,N.Uwatoko,Y.Ikeda,etal.AllelicdiversificationatthewxlocusinlandracesofAsianrice.TheorApplGenet,2008,116:979-989.[3]何鳳華,曾瑞珍,席章營,等.不同Wax基因型水稻的遺傳多樣性.分子植物育種,2003,1(2):179-186.[4]舒慶堯,吳殿星,夏英武,等.秈稻和粳稻中蠟質基因座位上微衛(wèi)星標記的多態(tài)性及其與表觀直鏈淀粉含量的關系.遺傳學報,1999，26(4)：350-358.[5]張建勇，陳德全李仕貴，馬玉清，等。利用分子標記鑒定水稻品種的Wx等位基因及其與直鏈淀粉含量的關系作物學報2005，04[6]包勁松舒慶堯吳殿星等水稻W(wǎng)x基因（CT）n微衛(wèi)星標記與稻米淀粉品質的關系研究農(nóng)業(yè)生物技術學報2000.8（3）241-244申報材料清單（申報論文一篇，相關資料名稱及數(shù)量）申報論文一篇《XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位》申報書一份科研管理部門簽章年月日

C.當前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。直鏈淀粉含量在5%-15%之間的低直鏈淀粉水稻，是介于一般粘米和糯米之間的中間類型，具有食味好、冷不回生、膨化性好等特點，是改良稻米直鏈淀粉含量和食味品質的理想材料。目前已經(jīng)報道了20多種低直鏈淀粉突變體,其直鏈淀粉均低于15%，胚乳外觀表型多為半透明或不透明，少數(shù)為透明的[1]。日本、韓國等東亞國家偏食軟性粳米，故對低直鏈淀粉含量水稻育種非常重視。日本自20世紀80年代中期開始進行低直鏈淀粉突變體誘變篩選和育種計劃，相繼育成MilkyQueen、Sari等一系列優(yōu)質低直鏈淀粉含量品種，深受商家和消費者歡迎。MilkyQueen是日本在1991年育成的低直鏈淀粉水稻品種，它是用N－甲基－N－亞硝基脲（MNU）處理“越光”的受精卵，獲得的低直鏈淀粉含量突變體,其直鏈淀粉含量為9%-12%。我國對低直鏈淀粉含量水稻品種選育的重視程度相當不夠。我國云南地區(qū)特有的軟米品種,是野生稻中自然發(fā)生的低直鏈淀粉含量突變體，直鏈淀粉含量在8%-15%之間[2]。目前我國發(fā)現(xiàn)的低直鏈淀粉突變體大多數(shù)為粳稻類型，有關秈稻類型的低直鏈淀粉突變體報道較少。根據(jù)與Wx基因等位性關系的不同，可將目前已報道的低直鏈淀粉含量突變體分為與Wx等位和非等位兩大類。其中Wx-mq，Wxop等屬于與Wx等位的低直鏈淀粉含量基因，而du,lam(t)等屬于與Wx非等位的基因。Wx-mq發(fā)現(xiàn)于日本培育的低直鏈淀粉栽培品種MilkyQueen中,經(jīng)研究控制MilkyQueen的低直鏈淀粉含量的基因是1個Wx的等位基因,并命名為Wx-mq[3]，Wx-mq基因已被克隆。在尼泊爾水稻品種中發(fā)現(xiàn)的不透明胚乳自然突變體,籽粒外觀與糯稻相似,直鏈淀粉含量在10%左右,研究發(fā)現(xiàn)其低直鏈淀粉含量由1個隱性單基因控制,與Wx基因等位,將其命名為Wxop[5]。du基因是獨立于Wx的隱性單基因，該類型突變基因表型胚乳均為半透明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)8個du基因,分別命名為du-1，du-2，du-3,du-4，du-5，du(EM47)，du(2120)和du(2035)，其中du(2035)，du(EM47)位于第6染色體，du-4du-1du(2120)分別位于第4,7,9染色體上[6-8]。lam(t)基因來源于北海道品種Shiokari，該基因為與Wx不等位的隱性單基因，位于第9染色體[4]。我國云南軟米品種毫屁、毫皮、毫木細和毫安悶的低直鏈淀粉性狀均由Wx復等位基因Wxhp控制[9]。目前du-1基因已被克隆[10]，尚未見到其它與Wx非等位低直鏈淀粉基因的克隆報道。對于水稻直鏈淀粉含量變化的分子機理，目前的研究主要集中于Wx復等位基因，有關非Wx低直鏈淀粉基因的調控機理研究較少。水稻中主要存在Wxa和Wxb兩種等位基因[11]，Wxa等位基因廣泛存在于秈稻，而Wxb等位基因主要存在于粳稻中。已有研究表明Wxa和Wxb的蛋白積累量主要和第一內(nèi)含子的剪接效率有關[12]，Aryes等[13]設計了SNP標記484/w2r用于分析直鏈淀粉含量變異。另外，該剪接位點上游存在一個(CT)n重復序列，序列重復次數(shù)與直鏈淀粉含量具有很高的相關性,秈稻品種(CT)n重復次數(shù)相對較少，粳稻相對較多，并根據(jù)此序列設計了特異性微衛(wèi)星引物484/485[14]。上述研究主要針對直鏈淀粉含量介于15-25%之間的常規(guī)水稻品種，但這些結果仍不能很好解釋直鏈淀粉含量水平的多樣性，尤其是低直鏈淀粉含量形成機制，郭濤等[15]的研究表明，秈型低直鏈淀粉突變體XLA-1,XLA-2（CT）n多態(tài)性與糯稻相同，但其直鏈淀粉含量明顯高于糯稻，說明還存在其它直鏈淀粉調控機制。在有關低直鏈淀粉合成調控機理方面，Zeng等[9]通過圖位克隆的方法得到了Du-1基因的全長序列，分析表明，du-1基因與其野生型在第一外顯子（+1742）處存在一個堿基替換（堿基G突變?yōu)锳），從而導致了氨基酸序列錯義突變（絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸），功能研究表明du-1可能是一個淀粉合成的調節(jié)因子，通過影響Wxb基因前體mRNA的剪接效率而降低直鏈淀粉含量。Isshhiki等[16]的研究表明，du-1和du-2不能形成類似于SR蛋白的剪接蛋白因子，使Wxb基因前體mRNA的正確剪接過程受到一定影響，從而導致直鏈淀粉含量降低。Sato等[17]克隆了Wx-mq全長cDNA，與野生型Wxb基因相比，在編碼區(qū)發(fā)生了2個堿基的替換，497位的G變?yōu)锳，595位的T變?yōu)镃，從而使相應的氨基酸序列產(chǎn)生了2個錯義突變，推測這2個錯義突變是造成直鏈淀粉含量下降的原因。馬曉東[9]的研究表明，四個云南軟米低直鏈淀粉基因均由Wx復等位基因Wxhp控制，該基因編碼區(qū)第四外顯子（+497個）處存在一個單堿基突變（堿基A突變?yōu)镚），編碼子由GAC突變?yōu)镚GC，導致了天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?，單核苷酸突變可能導致其空間構象發(fā)生變化，不能充分結合在淀粉粒上催化直鏈淀粉的形成，從而導致直鏈淀粉含量降低。以上研究均來源于粳稻低直鏈淀粉突變體，由于秈型非Wx低直鏈淀粉突變基因的克隆尚未報道，因此秈稻低直鏈淀粉合成機制有待進一步研究。綜上所述，低直鏈淀粉合成、加工和沉積途徑的分子機制目前仍尚未明晰，因此獲得各種類型的直鏈淀粉含量突變體（特別是秈型低直鏈淀粉突變體），通過各種方法克隆控制突變性狀的基因是解決上述問題的一個有效措施，并可為稻米直鏈淀粉改良提供優(yōu)良的遺傳資源。本實驗室利用空間誘變技術，已經(jīng)得到多個秈型低直鏈淀粉含量突變體[18]，這些突變體的獲得為深入闡明秈稻直鏈淀粉調控機理奠定了材料基礎。參考文獻[1]朱昌蘭，沈文飚,翟虎渠,等.水稻低直鏈淀粉含量基因育種利用的研究進展.中國農(nóng)業(yè)科學2004，37(2):157-162.[2]曾亞文,申時全,楊忠義,等.云南稻種資源的蒸煮食味品質研究.西南農(nóng)業(yè)大學學報,2001,23(5):408-41[3]SatoH,SuzukiY,OkunoK,etal.Geneticanalysisoflow-amylosecontentinaricevariety'MilkyQueen'.JapanBreedingResearch,2001,3:13-19..[4]SatoH.Statusandperspectivesontheresearchesoflowamylosecontentrice.JapanAgricultureandHorticulture,2002,77(5):20-28.[5]MikamiI,AikawaM,HiranoHY,etal.Alteredtissue-specificexpressionattheWxgeneofopaquemutantsinrice.Euphytica,1999,105:91-97.[6]OkunoK,NagamineT,OkaM.Newlinesharboringdugenesforlowamylasecontentinendospermstarchofrice.JapanAgriculturalResearchQuarterly,1993,27:102-105.[7]YanoM,OkunoK,SatoH,etal.Chromosomallocationofgenesconditioninglowamylasecontentofendospermstarchesinrice(OryzasativaL.).TheoreticalandAppliedGenetics,1988,76:183-189.[8]KaushikPP,KhushGS.Geneticanalysisofendospermmutantsinrice,OryzasativaL.TheoreticalandAppliedGenetics,1991,83:146-152.[9]馬曉東.四個云南軟米水稻品種低直鏈淀粉含量形成機制研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2007,p1.[10]DaliZeng,MeixianYan,YonghongWang,etal.Du1,encodinganovelPrp1protein,regulatesstarchbiosynthesisthroughaffectingthesplicingofWxbpre-mRNAsinrice(OryzasativaL.).PlantMolBiol,2007,65:501-509.[11]SanoY.Differentialregulationofwaxygeneexpressioninriceendosperm.TheorApplGenet，1984，68:467-473.[12]HiranoHY,SanoY.EnhancementofWxgeneexpressionandtheaccumulationofamylaseinresponsetocooltemperaturesduringseeddevelopmentinrice.Plantcellphysiol,1998,39(8):807-812.[13]AyresNM,McclungAM,LarkinPD,etal.Microsatellitesandasingle-nucleotidepolymorphismdifferentiateapparentamylaseclassesinanextendedpedigreeofUSricegermplasm.TheorApplGenet,1997,94:773-781.[14]BlighHF,TillRL,JONESCA.AmicrosatellitesequencecloselylinkedtothewaxygeneofOryzasativa.Euphytica,1995,86:83-85.[15]郭濤,韋璇,王慧,等.2個低直鏈淀粉含量秈稻突變體的遺傳分析.華南農(nóng)業(yè)大學學報,2009,30(1):10-13.[16]IsshikiM,NakajimaM,SatoH,etal.Dull:ricemutantswithtissue-specificeffectsonthesplicingofthewaxypre-mRNA.ThePlantJournal,2000,23(4):451-460.[17]SatoH,SuzukiY,SakaiM,etal.MolecularcharacterizationofWx-mq,anovelmutantgeneforlowamylosecontentinendospermofrice(OryzasativaL.).BreedingScience,2002,52:131-135.[18]郭濤,蔡金洋,王慧,等.水稻空間誘變SP2代品質性狀變異分析.華南農(nóng)業(yè)大學學報,2007,28(1):6-9.D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業(yè)技術職稱，并是與申報作品相同或相關領域的專家學者或專業(yè)技術人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認。推薦者情況姓名陳志強性別男年齡46職稱教授（博導）工作單位國家植物航天育種工程技術研究中心通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學科技樓711室郵政編碼510642單位電話住宅電話推薦者所在單位簽章本實驗課題組共同推薦該作品參與“挑戰(zhàn)杯”作品競賽（簽章）年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述胡小梅同學的參賽作品《XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位》是該同學承擔的科技創(chuàng)新計劃（已結題）項目研究內(nèi)容之一。胡小梅同學及其組員在我“中心”實驗室開展了大量的品質分析、分子生物學相關試驗，方法科學、數(shù)據(jù)翔實可靠。請對作品的意義、技術水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價水稻是禾本科作物基因組研究的模式植物，目前在水稻中已經(jīng)報道的淀粉合成相關基因有20多個,但這些基因如何相互作用調控淀粉的含量與結構尚未明確發(fā)現(xiàn)，因此，非Wx低直鏈淀粉基因的精細定位和克隆對研究禾本科作物的淀粉合成機理和品質育種具有重要的意義。該作品在秈稻中鑒定出一個非Wx直鏈淀粉調控因子，在理論及實踐上均具有較大意義。其它說明推薦者情況姓名劉向東性別男年齡43職稱教授（博導）工作單位華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院分子遺傳育種重點實驗室通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院818室郵政編碼510642單位電話住宅電話推薦者所在單位簽章（簽章）年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述胡小梅同學及其組員在農(nóng)學院航天育種實驗室開展了參賽作品《XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位》的主體實驗工作，實驗中采用的遺傳分析和基因定位方法得當，經(jīng)審閱其調查記錄，該作品數(shù)據(jù)真實、可靠，結果準確。請對作品的意義、技術水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價作品通過分析低直鏈淀粉突變體與野生型Wx基因的多態(tài)性關系，對糯稻的低直鏈淀粉基因進行了分子標記和遺傳分析。作品選題具有意義，使用分析技術合適。試驗結果豐富了水稻的低直鏈淀粉基因資源，對改良高直鏈淀粉材料的育種實踐具有一定的價值。其它說明學校組織協(xié)調機構確認并蓋章（團委代章）年月日校主管領導或校主管部門確認蓋章年月日E．大賽組織委員會秘書處資格和形式審查意見組委會秘書處資格審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處形式審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處審查結果□合格□不合格負責人（簽名）年月日

F．參賽作品打印處XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位胡小梅彭景芳趙娟陳月柳鄧杏摘要：在前期研究基礎上，本研究以低直鏈淀粉突變體XLA-1為材料，利用SSR標記與作圖群體，在第6染色體上端定位了一個非Wx基因lac（暫命名），該基因位于SSR標記RM19288、RM19297之間，遺傳距離分別為5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通過與已定位的低直鏈淀粉突變基因位置比對，初步表明lac為一新的秈稻低直鏈淀粉含量基因。通過該基因的獲得，豐富了秈稻的低直鏈淀粉基因資源，也為該基因的精細定位和圖位克隆研究打下了良好的基礎。關鍵詞：XLA-1低直鏈淀粉基因遺傳分析分子定位Summary:BasedonthepublishedWxgenesequenceanalysis,apairofspecificprimer(484/485)wereusedtoamplifythefull-lengthsequenceofWxgenefromthemutant.SequencinganalysisshowedWxgenepolymorphismbetweenthelowamylosemutantandwild-type.Toexplainthegeneticmechanismofthemutantgene,themutantXLA-1hybridedseparatelywiththewild,highamyloseparents,glutinousrice.TheseparationofamylosetraitsinF1,F2,BCF1populationwereanalysed.ThelargepopulationsofF2generationwereobtainedbythehybridizationofXLA-1withmedium-andhighamyloseparents,respectively.ThegeneticdistancebetweenthemolecularmarkersandthemutantgenewerecalculatedfromF2generationoflowamyloseindividualplantsbyuseofthestealthgroupmethodandmolecularmarkerlinkageanalysisofthemutantgenes.Keywords：XLA-1contentsofamylasehiddengroupsmoleculargeneticmarkersgeneticanalysis水稻是我國第一大糧食作物，其總產(chǎn)量與播種面積列世界第一，二位【1】。近年來農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量不斷提高，人們對于大米的品質的要求越來越高。而影響大米口感的一個重要因素就是水稻中直鏈淀粉含量，相對來說，直鏈淀粉含量越低，食味品質較好。研究表明除栽培條件對稻米中直鏈淀粉含量有影響外，直鏈淀粉在不同品種之間的含量差異是可遺傳的特性【2】，即水稻中直鏈淀粉含量是由基因控制的。直鏈淀粉含量在5%-15%之間的低直鏈淀粉水稻，是介于一般粘米和糯米之間的中間類型，具有食味好、冷不回生、膨化性好等特點，是改良稻米直鏈淀粉含量和食味品質的理想材料。目前已經(jīng)報道了20多種低直鏈淀粉突變體,其直鏈淀粉均低于15%，胚乳外觀表型多為半透明或不透明，少數(shù)為透明的[3]。日本、韓國等東亞國家偏食軟性粳米，故對低直鏈淀粉含量水稻育種非常重視。日本自20世紀80年代中期開始進行低直鏈淀粉突變體誘變篩選和育種計劃，相繼育成MilkyQueen、Sari等一系列優(yōu)質低直鏈淀粉含量品種，深受商家和消費者歡迎。MilkyQueen是日本在1991年育成的低直鏈淀粉水稻品種，它是用N－甲基－N－亞硝基脲（MNU）處理“越光”的受精卵，獲得的低直鏈淀粉含量突變體,其直鏈淀粉含量為9%-12%。我國對低直鏈淀粉含量水稻品種選育的重視程度相當不夠。我國云南地區(qū)特有的軟米品種,是野生稻中自然發(fā)生的低直鏈淀粉含量突變體，直鏈淀粉含量在8%-15%之間[4]。目前我國發(fā)現(xiàn)的低直鏈淀粉突變體大多數(shù)為粳稻類型，有關秈稻類型的低直鏈淀粉突變體報道較少。根據(jù)與Wx基因等位性關系的不同，可將目前已報道的低直鏈淀粉含量突變體分為與Wx等位和非等位兩大類。其中Wx-mq，Wxop等屬于與Wx等位的低直鏈淀粉含量基因，而du,lam(t)等屬于與Wx非等位的基因。Wx-mq發(fā)現(xiàn)于日本培育的低直鏈淀粉栽培品種MilkyQueen中,經(jīng)研究控制MilkyQueen的低直鏈淀粉含量的基因是1個Wx的等位基因,并命名為Wx-mq[5]，Wx-mq基因已被克隆。在尼泊爾水稻品種中發(fā)現(xiàn)的不透明胚乳自然突變體,籽粒外觀與糯稻相似,直鏈淀粉含量在10%左右,研究發(fā)現(xiàn)其低直鏈淀粉含量由1個隱性單基因控制,與Wx基因等位,將其命名為Wxop[6]。du基因是獨立于Wx的隱性單基因，該類型突變基因表型胚乳均為半透明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)8個du基因,分別命名為du-1，du-2,du-3，du-4，du-5，du(EM47)，du(2120)和du(2035)，其中du(2035)，du(EM47)位于第6染色體，du-4du-1du(2120)分別位于第4,7,9染色體上[7-9]。lam(t)基因來源于北海道品種Shiokari，該基因為與Wx不等位的隱性單基因，位于第9染色體[10]。我國云南軟米品種毫屁、毫皮、毫木細和毫安悶的低直鏈淀粉性狀均由Wx復等位基因Wxhp控制[11]。目前du-1基因已被克隆[12]，尚未見到其它與Wx非等位低直鏈淀粉基因的克隆報道。對于水稻直鏈淀粉含量變化的分子機理，目前的研究主要集中于Wx復等位基因，有關非Wx低直鏈淀粉基因的調控機理研究較少。水稻中主要存在Wxa和Wxb兩種等位基因[13]，Wxa等位基因廣泛存在于秈稻，而Wxb等位基因主要存在于粳稻中。已有研究表明Wxa和Wxb的蛋白積累量主要和第一內(nèi)含子的剪接效率有關[14]，Aryes等[15]設計了SNP標記484/w2r用于分析直鏈淀粉含量變異。另外，該剪接位點上游存在一個(CT)n重復序列，序列重復次數(shù)與直鏈淀粉含量具有很高的相關性,秈稻品種(CT)n重復次數(shù)相對較少，粳稻相對較多，并根據(jù)此序列設計了特異性微衛(wèi)星引物484/485[16]。上述研究主要針對直鏈淀粉含量介于15-25%之間的常規(guī)水稻品種，但這些結果仍不能很好解釋直鏈淀粉含量水平的多樣性，尤其是低直鏈淀粉含量形成機制，郭濤等[17]的研究表明，秈型低直鏈淀粉突變體XLA-1,XLA-2（CT）n多態(tài)性與糯稻相同，但其直鏈淀粉含量明顯高于糯稻，說明還存在其它直鏈淀粉調控機制。在有關低直鏈淀粉合成調控機理方面，Zeng等[18]通過圖位克隆的方法得到了Du-1基因的全長序列，分析表明，du-1基因與其野生型在第一外顯子（+1742）處存在一個堿基替換（堿基G突變?yōu)锳），從而導致了氨基酸序列錯義突變（絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸），功能研究表明du-1可能是一個淀粉合成的調節(jié)因子，通過影響Wxb基因前體mRNA的剪接效率而降低直鏈淀粉含量。Isshhiki等[19]的研究表明，du-1和du-2不能形成類似于SR蛋白的剪接蛋白因子，使Wxb基因前體mRNA的正確剪接過程受到一定影響，從而導致直鏈淀粉含量降低。Sato等[20]克隆了Wx-mq全長cDNA，與野生型Wxb基因相比，在編碼區(qū)發(fā)生了2個堿基的替換，497位的G變?yōu)锳，595位的T變?yōu)镃，從而使相應的氨基酸序列產(chǎn)生了2個錯義突變，推測這2個錯義突變是造成直鏈淀粉含量下降的原因。馬曉東[18]的研究表明，四個云南軟米低直鏈淀粉基因均由Wx復等位基因Wxhp控制，該基因編碼區(qū)第四外顯子（+497個）處存在一個單堿基突變（堿基A突變?yōu)镚），編碼子由GAC突變?yōu)镚GC，導致了天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?，單核苷酸突變可能導致其空間構象發(fā)生變化，不能充分結合在淀粉粒上催化直鏈淀粉的形成，從而導致直鏈淀粉含量降低。以上研究均來源于粳稻低直鏈淀粉突變體，由于秈型非Wx低直鏈淀粉突變基因的克隆尚未報道，因此秈稻低直鏈淀粉合成機制有待進一步研究。綜上所述，低直鏈淀粉合成、加工和沉積途徑的分子機制目前仍尚未明晰，因此獲得各種類型的直鏈淀粉含量突變體（特別是秈型低直鏈淀粉突變體），通過各種方法克隆控制突變性狀的基因是解決上述問題的一個有效措施，并可為稻米直鏈淀粉改良提供優(yōu)良的遺傳資源。本實驗室利用空間誘變技術，已經(jīng)得到多個秈型低直鏈淀粉含量突變體[21]，這些突變體的獲得為深入闡明秈稻直鏈淀粉調控機理奠定了材料基礎。韋璇[21]對空間誘變材料秈小占的低直鏈淀粉突變體XLA-1與高直鏈淀粉品種華航一號雜交的遺傳分析表明，XLA-1與高直鏈淀粉親本雜交的F2代籽粒直鏈淀粉出現(xiàn)高低分離，且分離比例不符合3：1的分離模式，初步推測XLA-1低直鏈淀粉遺傳特性受2對隱性基因控制，它們具有連鎖關系和互補作用，這2對基因1對可能是Wx的等位基因，另一對可能是與Wx不等位的基因，兩者均控制直鏈淀粉合成過程中的某一個環(huán)節(jié)，任何1對基因隱性純合都將導致直鏈淀粉含量降低；XLA-1與糯稻的雜交后代出現(xiàn)許多介于雙親之間及超親的高直鏈淀粉含量籽粒，初步證明另1對突變基因為非Wx的基因位點（暫命名為lac）。從淀粉合成關鍵酶的角度分析，XLA-1的直鏈淀粉含量下降的主因與SBE酶活性的增大關系密切。在前期研究基礎上，本研究對XLA-1中所含有的非Wx突變基因lac進行初步定位，研究結果對豐富水稻品質育種基因資源具有一定的理論和實踐價值。1材料與方法1.1實驗材料1.1.1水稻供試材料利用分子標記從XLA-1/華航一號F2代群體中篩選出的目的基因型低直鏈淀粉含量品系，該品系的直鏈淀粉特性受非Wx基因lac調節(jié)（基因型為WxWxlaclac）,命名為HXLA。高直鏈淀粉個體：秈小占（WxWxLacLac）1.2實驗方法1.2.1雜交設計2009年6月，以低直鏈淀粉種質HXLA為母本與高直鏈淀粉親本秈小占為父本雜交，獲得F1種子，2009年晚造自交得到F2籽粒群體。1.2.2雜交方法采用溫燙去雄法殺雄，上午8時至11時進行。首先在保溫瓶中灌滿45℃1.2.3稻米直鏈淀粉含量的測定方法集團法：參照GB-7648-87法，用SDM-A型旋風式磨粉機將待測試樣的整經(jīng)米磨成粉，稱取100±0.5mg米粉樣品加入100mL容量瓶，加入1.0mLφ=95%酒精使其分散，9.0mL1mol/LNaOH煮沸10min，冷卻定容，吸取5.0mL樣品溶液移入另一100mL容量瓶（同時吸取5.0mL0.09mol/LNaOH作為對照），加入1.00mL1mol/L乙酸、1.50mLI2-kI溶液，定容，20min后用分光光度計測定620nm下吸光值（OD620nm）。集團法標準曲線繪制：稱取與待測樣品保存在同樣的條件下三天以上的高、中、低已知直鏈淀粉含量的標準樣品各100mg，用上述方法與待測樣品同時進行測定。以標樣的直鏈淀粉為縱坐標，以相應的吸光值為橫坐標，繪制標準曲線和列出曲線的回歸方程式。重復測定一次，兩次結果的誤差應在1.0%，取平均值即為直鏈淀粉含量。單粒法：將單粒去殼去胚后，放入25mL容量瓶，加入0.25mLφ=95%酒精及2.25mL1mol/LNaOH后，置于恒溫箱26℃糊化24h，使胚乳完全溶解。之后將容量瓶取出，振蕩搖勻后煮沸10min，冷卻定容吸取1.25mL樣品溶液移入另一25mL容量瓶（同時吸取1.25mL0.09mol/LNaOH作為對照），加入0.25mL1mol/L乙酸、0.375mLI2單粒法標準曲線繪制：稱取高、中、低已知直鏈淀粉含量的標準樣品各0.0100g，用上述方法與待測樣品進行測定。以表樣直鏈淀粉質量分數(shù)為縱坐標，以相對應的吸光值為橫坐標，繪制標準曲線和列出曲線的回歸方程式。親本的直鏈淀粉含量及HXLA/秈小占F1單株測定采用集團法，HXLA/秈小占F2的遺傳分析采用單粒法。1.2.4作圖群體的DNA獲得HXLA/秈小占的F2籽粒群體采用單粒法測定，把單粒分成兩部分，胚乳用于直鏈淀粉含量的測定，保留胚，并編號一一對應。把小于13.5%及大于22.5%的籽粒胚置于恒溫箱發(fā)芽，用營養(yǎng)液澆灌至三葉期，長出足夠多的葉片可提取DNA，用于構建作圖群體。1.2.5水稻基因組總DNA提取采用MurrayCTAB方法提取。1.2.6SSR標記篩選及候選基因標記確定韋璇[21]等利用XLA-1/華航一號雜交構建F2代群體，經(jīng)遺傳分析和蠟質基因Wx的(CT)n多態(tài)性分析表明，控制XLA-1低直鏈淀粉特性的另一對基因與Wx基因連鎖。根據(jù)上述研究，為快速確定該低直鏈淀粉基因，首先采用分離群體法（BulkedSegregantAnalysis,BSA）篩選與低直鏈淀粉基因連鎖的微衛(wèi)星標記，即利用HXLA與秈小占及高直鏈淀粉池與低直鏈淀粉池作為篩選模板進行擴增，待篩選出合適的SSR標記后進一步對高直鏈淀粉個體及低直鏈淀粉個體進行確定，確保標記的準確性。候選標記確定后，再根據(jù)隱性群體法（Recessive-classanalysis,RCA）對F2作圖群體的低直鏈淀粉個體進行確定，確定連鎖位置與遺傳距離。1.2.7近等基因池的構建從HXLA/秈小占F2代定位群體中隨機選取10個高直鏈淀粉籽粒個體的DNA等量混合成高直鏈淀粉基因池，同樣方法選取10個低直鏈淀粉籽粒個體的DNA等量混合成低直鏈淀粉基因池。1.2.8電泳檢測采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，大約3-4小時，結束后，雙蒸水洗膠兩次，每次約1分鐘，再用1g/L的AgNO3溶液染色約10分鐘，用雙蒸水洗膠兩次，用顯影液搖動顯影然后觀察分析。1.2.9連鎖分析本研究采用隱性群體法進行連鎖分析，重組率按Kosambi作圖函數(shù)轉換成遺傳距離（里摩爾根cM）。2結果分析2.1F1代直鏈含量測定結果從表2.1可以看出，HXLA與秈小占雜交得到的F1代籽粒直鏈淀粉含量居于雙親之間，其籽粒直鏈淀粉含量平均值低于中親值（20.95%<21.65%），且多數(shù)偏向于高直鏈淀粉含量親本，說明高直鏈淀粉含量對低直鏈淀粉含量表現(xiàn)不完全顯性，控制XLA-1低直鏈淀粉含量的突變基因屬于隱性基因。表2.1HXLA/秈小占F1代及親本直鏈淀粉含量表現(xiàn)值組合直鏈淀粉含量（%）♀♂F1MPF1-MPHXLA/秈小占17.4124.3720.9521.650.182.2F1代真種的分子標記鑒定XLA-1低直鏈淀粉遺傳特性受2對隱性基因控制，因此要排除Wx基因的影響，此外還要驗證雜交是否成功，本研究采用分子標記輔助的方法，對F1的植株逐一進行檢測，保證遺傳分析及分子定位的準確性。首先采用特異引物484/485特異引物進行(CT)n多態(tài)性鑒定，如圖2.1所示，選取只有和雙親相同帶型的植株，即編號為1、2、3、8、9；接著用雙親具有多態(tài)的引物RM225進行鑒定，如圖2.2所示，選取雜合帶型的植株，即編號為1、4、5、6、7、9、10。綜合篩選滿足條件的有1號植株，因此選取1號進行遺傳分析及分子定位。P1P212345678910P1P212345678910圖2.1HXLA/秈小占的F1在484/485特異引物擴增表現(xiàn)注：P1代表HXLA，P2代表秈小占，標號1-10代表HXLA/秈小占F1單株MP1P212345678910MP1P212345678910圖2.2HXLA/秈小占的F1在RM225引物擴增表現(xiàn)注：P1代表HXLA，P2代表秈小占，標號1~10代表HXLA/秈小占F1單株2.3F2代低直鏈淀粉基因的遺傳分析HXLA與秈小占雜交組合F2代籽粒群體的直鏈淀粉含量頻次分布圖如2.3，分離情況見表2.2。由圖2.3可以看出，HXLA與秈小占雜交F2代籽粒群體直鏈淀粉含量出現(xiàn)明顯3個峰，結合表2.2可知，低直鏈淀粉分界點為15%，高直鏈淀粉分界點為19%，其分離范圍為5.79%~27.50%。圖2.3HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體的直鏈淀粉含量頻次圖表2.2HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體變異范圍組合F2平均值分離范圍低AC分界點（%）高AC分界點（%）HXLA/秈小占16.76%5.79~27.501519卡平方檢測結果表明（見表2.3），HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體的直鏈淀粉含量分離比例符合1：2：1遺傳分離模式，即低直鏈淀粉含量個體：高直鏈淀粉含量個體為1：3遺傳分離，且χ2=2.07<χ20.05，根據(jù)孟德爾基因分離規(guī)律可知，低直鏈淀粉性狀符合一對基因遺傳分離模式，說明控制XLA-1低直鏈淀粉特性的基因是由一對隱性基因控制。表2.3HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體卡平方檢測結果組合AC分組總數(shù)實際比例χ2低中高HXLA/秈小占1363534892.59：12.07χ20.05=3.84（df=1）2.4作圖群體的構建根據(jù)遺傳分析的結果，在F2代籽粒分離群體的136個低直鏈淀粉個體中隨機選取直鏈淀粉含量小于13.5%的個體60個，構建作圖群體，利用隱性群體法對低直鏈淀粉基因進行連鎖分析及初步定位。2.5與低直鏈淀粉基因連鎖的SSR標記連鎖分析及分子定位為了確定低直鏈淀粉突變基因的位置，我們在Wx上端及下端處選取40對SSR引物，對親本HXLA和秈小占進行多態(tài)性篩選，在Wx基因上端處發(fā)現(xiàn)RM19254-RM19271-RM19283-RM19288-RM19289-RM19297出現(xiàn)連續(xù)的多態(tài)，通過近等基因池的鑒定，電泳檢測結果表明位于第六染色體的標記RM19288和RM19297在高直鏈淀粉基因池、低直鏈淀粉基因池以及兩親本中存在多態(tài)性，因此將這兩對標記確定為候選基因。接著用作圖群體來確定這兩個標記與低直鏈淀粉基因的連鎖關系，我們用這兩個標記分別對作圖群體中的60個體分別檢測，同時檢測雙親和近等基因池作為對照。結果表明在RM19288位點上鑒定到6個重組體，RM19297位點上鑒定到5個重組體（圖2.4和圖2.5）。重組率按Kosambi函數(shù)轉為為遺傳距離（里摩爾根cM），計算結果得出該突變基因lac位于RM19288、RM19297之間，與RM19288的距離為5.05cM，與RM19297的距離為4.1cM（圖2.6）。MM47913P1P2HL123568101112141516171819202122232425262728293045454644P1L343740P2H31323335363839414243M5358474849505152545556575960圖2.4SSR標記RM19288對60個F2代低AC個體的檢測結果注：M代表100bpladder,P1代表秈小占，P2代表HXLA，H代表高池，L代表矮池，1-60帶代表60個F2作圖個體MM47913P1P2HL123568101112141516171819202122232425262728293045454644P1L343740P2H31323335363839414243M5358474849505152545556575960圖2.5SSR標記RM19297對60個F2代低AC個體的檢測結果注：M代表100bpladder,P1代表秈小占，P2代表HXLA，H代表高池，L代表矮池，1-60帶代表60個F2作圖個體圖2.6低直鏈淀粉基因lac的局部分子標記連鎖圖3小結與討論迄今為止，已報道的非Wx主效基因控制直鏈淀粉含量的基因都來自于粳稻，而來自秈稻尚未報道。秈稻低直鏈淀粉含量主要是受Wx基因的復等位基因控制，例如Wx-mq、Wxop、Wxmp。位于第6染色體染色體控制低直鏈淀粉含量的基因主要是du-2、du(2035)，都是由親本Sasanishiki通過EMS突變方式定位出來。國內(nèi)外許多學者對水稻直鏈淀粉的遺傳機理進行了不少研究，但由于直鏈淀粉直鏈淀粉含量遺傳的復雜性，使得研究結果眾說紛紜。多數(shù)研究者認為稻米直鏈淀粉含量受控于一個主效基因和幾個微效基因，不同品種所帶的主效基因不同。李廣賢[23]等報道在第1、3、4、5、6、7、8、9、12染色體上均有檢測到該性狀的QTL報道。綜合前人的研究，水稻第6染色體上存在一個控制直鏈淀粉含量的Wx基因位點，黃祖六[24]等對稻米直鏈淀粉含量基因座位進行分子標記研究，表明位于第6染色體的Wx基因與R1962緊密連鎖，距離為3.6cM,另外還在第3染色體上檢測到一個與R2170緊密連鎖的主效基因，且兩個基因之間的作用是獨立的。本研究結果表明，低直鏈淀粉基因lac位于第6染色體上端的SSR標記RM19288、RM1929之間，分別相距5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通過與du-2、du(2035)相比對，發(fā)現(xiàn)XLA-1產(chǎn)生的低直鏈淀粉基因與du-2、du(2035)不等位，結合遺傳分析結果表明lac為一新的低直鏈淀粉含量基因。通過對該基因的獲得，豐富了水稻的低直鏈淀粉基因資源，也為該基因的精細定位和圖位克隆研究打下了良好的基礎。參考文獻[1]沈鎮(zhèn)昭,梁書升.中國農(nóng)業(yè)年鑒.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006:30-39.[2]蔡秀玲劉巧泉顧銘洪等用于篩選直鏈淀粉含量為中等的秈稻品種的分子標記植物生理與分子生物學學報2002.28（2）：137-144[3]朱昌蘭，沈文飚,翟虎渠,等.水稻低直鏈淀粉含量基因育種利用的研究進展.中國農(nóng)業(yè)科學2004，37(2):157-162.[4]曾亞文,申時全,楊忠義,等.云南稻種資源的蒸煮食味品質研究.西南農(nóng)業(yè)大學學報,2001,23(5):408-41.[5]SatoH,SuzukiY,OkunoK,etal.Geneticanalysisoflow-amylosecontentinaricevariety'MilkyQueen'.JapanBreedingResearch,2001,3:13-19.[6]MikamiI,AikawaM,HiranoHY,etal.Alteredtissue-specificexpressionattheWxgeneofopaquemutantsinrice.Euphytica,1999,105:91-97.[7]OkunoK,NagamineT,OkaM.Newlinesharboringdugenesforlowamylasecontentinendospermstarchofrice.JapanAgriculturalResearchQuarterly,1993,27:102-1