第二十五章 細(xì)胞免疫檢測技術(shù)課件

14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)第一節(jié)E花環(huán)試驗

第二十五章細(xì)胞免疫檢測技術(shù)14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)豚鼠T細(xì)胞表面有E受體=CD2.家兔紅細(xì)胞（RBC）表面有CD2的配體，即CD58.將淋巴細(xì)胞與RBC按一定比例混合后，在一定條件下就形成一個T細(xì)胞結(jié)合多個SRBC的玫瑰花一樣的花環(huán)，即E-花環(huán)(erythrocyterosette)，取樣涂片染色、鏡檢計數(shù)可得花環(huán)形成率。E-花環(huán)實驗原理CD2andCD58

smilarstructure?ligandofCD2---CD58ligandofCD58---CD2?CD2alsocalledSRBC-R(綿羊紅細(xì)胞受體)14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗主要是間接了解淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實驗主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測定第二節(jié)淋巴細(xì)胞的功能檢測14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)淋巴細(xì)胞T細(xì)胞（負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫功能）B細(xì)胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK和K細(xì)胞（非特異性免疫作用）14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)一、T細(xì)胞功能的檢測T細(xì)胞增殖試驗T細(xì)胞分泌功能測定T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗體內(nèi)試驗14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗1.原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：PHA------T細(xì)胞ConA-------T細(xì)胞PWM-------T、B細(xì)胞LPS-------B細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原

14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)3.檢測方法

形態(tài)法：刺激物淋巴細(xì)胞（4-6天）母細(xì)胞化同位素法：PHA淋巴細(xì)胞（54h）DNA合成期+3HTdR摻入

收集細(xì)胞

檢測β射線

測定細(xì)胞內(nèi)的3H－TdR14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)方法學(xué)評價：優(yōu)點：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實驗室應(yīng)用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。（1）形態(tài)學(xué)檢查法14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)（2）3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復(fù)性好。缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(二)T細(xì)胞分泌功能測定體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。

14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗1.原理：靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞計數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞同位素法：淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測定γ射線2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(四)體內(nèi)試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)二、B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞增殖能力的試驗溶血空斑試驗B細(xì)胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(一)B細(xì)胞增殖能力的試驗抗IgM細(xì)菌脂多糖SAC的SPA

B細(xì)胞增殖形態(tài)學(xué)3H－TdR摻入法14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(二)溶血空斑試驗1.原理：14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(三)B細(xì)胞抗體形成功能的檢測

——酶聯(lián)免疫斑點法1.原理：14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)2．應(yīng)用與方法學(xué)評價：該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細(xì)胞。14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(四)體內(nèi)試驗體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細(xì)胞熒光測發(fā)光強度測CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法三、NK細(xì)胞活性測定靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞:

K562細(xì)胞株14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)第三節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。一、中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù)二、巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)一、中性粒細(xì)胞功能的檢測細(xì)胞趨化功能的檢測吞噬和殺菌功能的檢測14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(一)細(xì)胞運動功能——趨化功能檢測瓊脂糖平板法

濾膜滲透法（Boyden小室法）14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(二)吞噬和殺菌功能測定1．顯微鏡檢查法：14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)2.溶菌法3．NBT還原試驗

14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)二、巨噬細(xì)胞功能檢測(一)炭粒廓清試驗正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(二)吞噬功能檢測巨噬細(xì)胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細(xì)胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細(xì)胞。14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(三)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測定1．酸性磷酸酶的測定硝酸鉛法偶氮法2．非特異性酯酶的測定常用α-萘醋酸法(四)細(xì)胞毒作用測定用IFN-γ激活小鼠巨噬細(xì)胞，觀察其對125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細(xì)胞瘤P815的殺傷活性。14-2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)(五)巨噬細(xì)胞促凝血活性測定激活的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37℃預(yù)溫的正常兔血漿和CaCl2混合