DB21T 2469-2015 H1N1亞型豬流感病毒熒光RT-PCR檢測方法　

ICS11.220B41DB21DB21/T2469—2015H1N1亞型豬流感病毒熒光RT-PCR檢測方法MethodoffluorescentRT-PCRforthedetectionofH1N1swineinfluenzavirus遼寧省質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2469—2015本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省動物疫病預防控制中心提出。本標準由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標準起草單位：遼寧省動物疫病預防控制中心、遼寧省動物醫(yī)學研究院。本標準主要起草人：關淼、曹東、蘭德松、魏澍、趙鳳菊、陳瑤、姚偉、劉坤洋、張雷、楊國麗、魏園園1DB21/T2469—2015H1N1亞型豬流感病毒熒光RT-PCR檢測方法本標準規(guī)定了H1N1亞型豬流感病毒（swineinfluenzavirus，SIV）熒光RT-PCR檢測方法的范圍、器材和試劑、引物和探針、操作步驟、結(jié)果判定和廢棄物處理。本標準適用于H1N1亞型豬流感的診斷、監(jiān)測以及流行病學調(diào)查，適用于豬鼻咽棉拭子、肺臟及肺臟淋巴結(jié)、雞胚尿囊培養(yǎng)液以及細胞培養(yǎng)物中H1N1亞型SIVHA和NA基因的檢測。本標準中的試驗操作應在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實驗室進行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范病原微生物實驗室生物安全環(huán)境管理辦法GB/T27521-2011豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法GB/T27536-2011豬流感病毒分離與鑒定方法3縮略語本標準涉及下述縮略語。SIV：豬流感病毒（swineinfluenzavirus）熒光RT-PCR：熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（realtimefluozescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction）PCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）cDNA：互補脫氧核糖核酸（complementaryDNA）HA：血凝素（Hemagglutinin）NA：神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase）PBS：磷酸緩沖液（配方見附錄Aphosphatebuffersolution）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）4原理SIV是一種RNA病毒。RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA可作為PCR模板進行擴增。根據(jù)H1N1亞型SIV保守基因序列設計一對特異性引物以及一個TaqMan探針，在酶催化下，以母鏈DNA為模板，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA。Taqman探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光集團和一個淬滅熒光集團。2DB21/T2469—2015在PCR擴增時，探針被酶切降解，使報告熒光集團和淬滅熒光集團分離，就形成可被儀器接受的熒光信5器材和試劑5.1器材高速臺式冷凍離心機（最高轉(zhuǎn)數(shù)12000r/min以上）；冰箱（2～8℃,-20℃和-70℃三種）；混合器；熒光PCR擴增儀；微量移液器；病毒采集管；PCR八聯(lián)排管或96孔板；吸頭（10μL，200μL，1000μL）；無菌注射器；1.5mL離心管、15mL離心管經(jīng)121(±2）℃高壓滅菌15min；研缽或組織勻漿器、眼科剪、眼科鑷、剪刀、鑷子經(jīng)160℃干熱滅菌2h。5.2試劑PBS：121(±2）℃高壓滅菌15min，冷卻后，無菌條件下分別加入10000U/mL青霉素、鏈霉素。Trizol：RNA抽提試劑，外觀為粉紅色，4～8℃保存。氯仿：4℃預冷。異丙醇：4℃預冷。75%乙醇：用新開封的無水乙醇和DEPC水配制，-20℃保存。DEPC水：1mLDEPC溶于1L去離子水配制成0.1%DEPC水，37℃作用1h，然后121(±2）℃,高壓滅菌15min，避光，于密閉容器中2～8℃保存。RNA酶抑制劑（40U/μL）。DNA聚合酶：ExTaqHS（5U/μL）。6引物和探針用于RT-PCR反應的引物濃度為20μmol/L，其序列如下：H1HA基因引物：上游引物F1：5’-CCTCTACCAGAATAATCATAC-3’、下游引物R1：5’-CAGTGTCCAGTAATAATTCA-3’、探針P1：5’-（FAM）TCTGCCTGCTTGTTCTCTGACT（Eclipse）-3’；N1NA基因引物：上游引物F2：5’-CCCATATCGAACATTGATG-3’、下游引物R2：5’-GTCTGTTATTATGCCATTGTA-3’、探針P2：5’-（FAM）CTGTCCTATTGGTGAGGTTCCTTCT（Eclipse）-3’。注：除另有說明，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。7操作步驟7.1樣品的采集、前處理、存放和運送7.1.1鼻咽棉拭子根據(jù)GB/T27521-2011《豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法》進行鼻咽棉試子的采集與前處理。7.1.2肺臟及肺臟淋巴結(jié)根據(jù)GB/T27521-2011《豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法》進行肺臟及肺臟淋巴結(jié)的采集與前處理。7.1.3雞胚尿囊液根據(jù)GB/T27536-2011《豬流感病毒分離與鑒定方法》進行雞胚培養(yǎng)及尿囊液的收取，一般一個雞胚可以收獲5～10mL尿囊液，分裝入1.5mL離心管中，編號備用。7.1.4細胞培養(yǎng)物3DB21/T2469—2015細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，編號備用。7.1.5存放與運送用于病毒分離和RT-PCR檢測的樣品在采集或處理后，在2～8℃條件下保存不超過24h；若需長期保存，放置于-70℃或以下溫度保存，避免反復凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品置于保溫器材中加冰袋密封，在6～8h之內(nèi)運送到實驗室。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標識。7.2實時熒光RT-PCR檢測7.2.1RNA提取取n個滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對照管數(shù)+陰性對照管數(shù)，對每個離心管進行編號；每管加入750μLTrizol，分別加入被檢樣品、陽性對照和陰性對照各250μL，顛倒10次混勻，室溫靜置5min；再加入250μL氯仿，混勻器上振蕩混勻15s（也可以用手反復顛倒混勻4℃12000r/min離心15min；取與第一步中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，加入500μL異丙醇(4℃預冷)；取第三步中離心后的上清液約500μL轉(zhuǎn)移至已加入氯仿的相應的管中，顛倒混勻，室溫靜置15min，4℃12000r/min離心15min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入1mL75%乙醇，4℃12000r/min離心10min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；4000r/min離心10s，用微量加樣器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3～10min；加入18μL經(jīng)DEPC處理的水和2μLRNA酶抑制劑，輕柔混勻，溶解管壁上的RNA，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA在2h內(nèi)進行RT-PCR擴增；于-70℃冰箱長期保存。7.2.2配置擴增體系配制HA基因擴增反應液，設實時熒光PCR反應數(shù)為n，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性管數(shù)+陰性管數(shù)，每個樣本檢測反應體系按下列組份配制，向每個熒光PCR管或孔中分裝23μL的反應體系。NA基因擴增反應液配制方法同HA基因。反應體系：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μLEXTaqHS0.5μLPrimeScriptRTenzymeMixⅡ0.5μL上游引物F0.25μL下游引物R0.25μL探針PROXReferenceDyeorDyeⅡ0.5μLRNaseFreedH2O8.25μL7.2.3加樣在各設定的熒光PCR管中加入7.2.1中制備的2μLRNA模板溶液。蓋緊管蓋，除氣泡，500r/min離心30s。7.2.4熒光RT-PCR擴增7.2.4.1將7.2.3中離心后的PCR管放入熒光PCR擴增儀內(nèi)，記錄樣品擺放次序。7.2.4.2HA和NA基因擴增反應條件均為：第一階段：42℃5min，95℃10sec；第二階段：95℃5sec，60℃34sec，40個循環(huán)，60℃時設置采集熒光信號。熒光集團設定：檢測熒光ReportDye4DB21/T2469—2015設定為FAM，淬滅熒光QuenchDye設定為None，校準熒光ReferenceDye設定為Rox。試驗結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。8結(jié)果判定8.1質(zhì)控標準8.1.1陰性對照無Ct值，且無擴增曲線。8.1.2陽性對照Ct值應小于28