第十八章-體外受精胚胎移植技術(shù)-劉平

第十八章體外受精胚胎移植技術(shù)（InVitroFertilizationandEmbryoTransfer，IVF-ET）劉平第一節(jié)IVF-ET概況和發(fā)展史體外受精-胚胎移植技術(shù)是人類輔助生殖技術(shù)（AssistedReproductiveTechnology，ART）的基本內(nèi)容和核心技術(shù)，俗稱“試管嬰兒”技術(shù)。他們?nèi)〕鲆蜉斅压茏枞挥幕颊週esley的卵子與丈夫的精子行體外授精后，將發(fā)育的胚胎移植回Lesley的子宮內(nèi)。1978年7月25日，Lesley終于分娩了世界上第一例試管嬰兒LouiseBrown。至此人類IVF-ET技術(shù)正式建立。1985年4月和1986年12月，我國臺灣、香港先后誕生了兩地的首例試管嬰兒。1988年3月10日，大陸的首例試管嬰兒也在北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院張麗珠教授領(lǐng)導(dǎo)的生殖中心誕生。當(dāng)今國際上采用的助孕新技術(shù)多數(shù)是從IVF-ET衍生出來的。1978年7月25日，世界首例試管嬰兒LouiseBrown在英國劍橋誕生，成為20世紀醫(yī)學(xué)史上的里程碑。如果從Schenck嘗試在體外完成受精和Heape將供體兔子的胚胎成功地移植到受體子體內(nèi)開始，哺乳類的胚胎移植技術(shù)已有了一百多年的歷史。上個世紀60年代初期，家兔卵體外受精科學(xué)試驗首次成功，激發(fā)了胚胎學(xué)家Prof.RobertG.Edwards想要嘗試進行人卵體外受精的實驗研究愿望，他與婦產(chǎn)科專家Mr.PatrickSteptoe進行了十多年的合作努力，歷經(jīng)百余次失敗后，終于利用腹腔鏡技術(shù)，獲取自然周期的1枚排卵前卵母細胞，體外受精后形成的胚胎移植獲得成功妊娠分娩。全球許多國家生殖專家對研究這項劃時代的新技術(shù)充滿熱情，相繼在印度、澳大利亞、美國、歐洲多國獲得成功臨床應(yīng)用。1985年4月和1986年12月我國的臺灣省和香港分別誕生了試管嬰兒。中國首例大陸試管嬰兒在1988年3月誕生于北醫(yī)三院。在世界首例試管嬰兒誕生三十多年之后，2010年RobertG.Edwards獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎，按照當(dāng)年諾獎頒獎時估計，全世界已經(jīng)有約300萬個家庭通過IVF-ET技術(shù)得到自己的后代，試管嬰兒數(shù)量也達到了400萬個以上。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）評估，世界上每7對夫婦中約有1對夫婦存在生殖障礙。我國近期調(diào)查，國內(nèi)不孕癥者占已婚夫婦人數(shù)的10%，比1984年調(diào)查的4.8%增加一倍多，發(fā)病率呈上升趨勢。臨床統(tǒng)計，不育患者中約20%的夫婦，不借助ART就根本無法生兒育女。在不孕癥病因中男性因素引起的不孕約占30%，女性因素約占50%，雙方因素約占20%。常規(guī)的或稱為傳統(tǒng)的IVF-ET技術(shù)主要是針對女性因素所致不孕癥或至少是在沒有嚴重的少弱精子癥時可以采用精子和卵混合培養(yǎng)方式完成體外受精，但對于曾經(jīng)嘗試常規(guī)受精但精卵未能自然結(jié)合，或因男性精子密度過低，活力較差等，或在評價精子功能后認為不能自然受精時，可以借助單精子卵母細胞內(nèi)注射受精技術(shù)實現(xiàn)精卵結(jié)合完成受精過程。單精子卵母細胞內(nèi)注射技術(shù)1992年在比利時首獲成功臨床應(yīng)用，隨后這項技術(shù)迅速普及和發(fā)展，成為治療男性原發(fā)性生精低下，嚴重少弱畸精子癥，阻塞性無精子癥等所致不育的最主要手段。1983年，TrounsonA報道首例經(jīng)凍融胚胎移植后成功妊娠分娩的試管嬰兒。如今，胚胎凍融技術(shù)已成為IVF中不可缺少的組成部分，胚胎凍融技術(shù)為充分利用促排卵周期形成的多余胚胎提供了保存和再利用的技術(shù)保障，避免胚胎浪費，增加累計妊娠機會。另外，近年來凍融胚胎技術(shù)還用于因促排卵周期發(fā)生卵巢過度刺激等新鮮周期不適宜移植的情況時，將全部胚胎凍存，在隨后的自然月經(jīng)周期或人工周期進行解凍胚胎移植，在更安全的情況下獲得更好的臨床結(jié)局。1991年英國學(xué)者開始將著床前胚胎遺傳學(xué)診斷技術(shù)（PreimplantationGeneticDiagnosis，PGD）用于臨床，這項技術(shù)是利用體外受精后形成的分裂球期胚胎的1個分裂球或囊胚期胚胎的少數(shù)滋養(yǎng)細胞進行相應(yīng)的遺傳分析。在不孕不育患者中，部分夫婦不是表現(xiàn)為受孕困難，而是反復(fù)發(fā)生自然流產(chǎn)或有畸形胎兒出生，這些常與夫婦中某一方或雙方存在易造成流產(chǎn)的遺傳異常有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)的人類遺傳病約4000余種，有些夫婦一方為異常染色體平衡攜帶者或性連鎖疾病攜帶狀態(tài)等，人群中存在這樣或那樣的遺傳缺陷。隨著單細胞分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，特別是CGH和SNP芯片技術(shù)的推廣，PGD技術(shù)的應(yīng)用近年來得到快速發(fā)展，使那些遺傳問題不能順利生育的夫婦有望得到正常后代，避免反復(fù)流產(chǎn)或畸形兒的出生。IVF-ET技術(shù)還成為研究人類生殖過程、遺傳病機制、干細胞定向分化等的重要臨床資源，而這些課題的深入研究積累經(jīng)驗，必將推動醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的繼續(xù)發(fā)展。第二節(jié)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)簡介將從母體取出的卵母細胞置于培養(yǎng)皿內(nèi)，利用適合人類卵母細胞生長的培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)，加入經(jīng)體外分離處理選擇出的有活力的精子，這些精子在與培養(yǎng)液接觸過程中已經(jīng)被誘導(dǎo)完成了體外獲能過程，精子和卵在體外共同培養(yǎng)過程中完成精卵結(jié)合的受精過程，受精卵繼續(xù)發(fā)育成早早期胚胎后，選擇受精正常且發(fā)育正常的胚胎移植回母體子宮內(nèi)，胚胎著床并且經(jīng)歷“十月懷胎”后嬰兒分娩。由于卵母細胞受精和受精卵及胚胎發(fā)育的最初幾天（最晚至囊胚期）是在體外培養(yǎng)環(huán)境中完成的，體外受精胚胎移植技術(shù)（IVF-ET）也被俗稱為“試管嬰兒技術(shù)”。IVF-ET技術(shù)的建立分為兩個部分，即臨床部分和體外受精胚胎培養(yǎng)實驗室部分，分別承擔(dān)不同的工作，只有兩個部分高度默契配合才能有效完成這項技術(shù)的臨床實施。臨床部分主要任務(wù)是從需要接受IVF-ET治療的不孕婦女體內(nèi)取出成熟的（或經(jīng)體外培養(yǎng)后能夠發(fā)育成熟的）卵母細胞，以及把培養(yǎng)所得的胚胎移植回母體內(nèi)（子宮或輸卵管）。實驗室部分則是把卵和精子在體外建立的培養(yǎng)環(huán)境中實現(xiàn)受精，并把受精卵培養(yǎng)成有活力的早早期胚胎。嚴重少弱精癥導(dǎo)致的男性不孕，則需要借助ICSI技術(shù)輔助受精，所以又把精卵混合培養(yǎng)受精稱為常規(guī)體外受精。按照不孕癥病因不同，因男性或女性因素引起的不孕或不育在接受助孕治療時需選擇不同的治療方式。按照我國衛(wèi)生行政管理規(guī)定，開展一體外受精輔助生殖技術(shù)植及其衍生技術(shù)目前主要包括體外受精/胚胎移植、配子/合子輸卵管內(nèi)移植或?qū)m腔內(nèi)移植、卵胞漿內(nèi)單精子注射（IntracytoplasmicSpermInjection，ICSI）、植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（PreimplantationGeneticDiagnosis，PGD）、卵子贈送、胚胎贈送等,均需要經(jīng)過衛(wèi)生行政部門的審批后才能開展。對這些機構(gòu)的基本要求包括人員和技術(shù)能力、場地要求、專用基本設(shè)備等。第三節(jié)IVF-ET適應(yīng)證隨著IVF-ET技術(shù)的不斷完善和普及，這項技術(shù)目前幾乎成為不孕癥治療的最后一張王牌，從醫(yī)療實踐中需警惕技術(shù)濫用和盲目擴大適應(yīng)證，但是當(dāng)經(jīng)過一定診治過程后認為無法自然懷孕的時候，常常會轉(zhuǎn)向借助IVF-ET技術(shù)，幾年來IVF-ET的適應(yīng)證在逐漸擴大。適應(yīng)證選擇是IVF-ET技術(shù)得以合理應(yīng)用的關(guān)鍵，對于有適應(yīng)證的患者夫婦還要評估其身體一般狀態(tài)和生育力狀態(tài)，當(dāng)身體健康狀態(tài)（健康體檢和傳染病排查）適合并能夠承受妊娠和分娩，且生育力評估后認為具備實施IVF-ET最基本要求時，可以啟動IVF-ET助孕治療后續(xù)流程。一、常規(guī)體外受精技術(shù)適應(yīng)證：1．輸卵管堵塞或功能障礙引起精卵運輸障礙導(dǎo)致的不孕在IVF技術(shù)出現(xiàn)之前，輸卵管因素引起的不孕主要通過輸卵管成型術(shù)復(fù)通輸卵管或期待治療，IVF技術(shù)為輸卵管因素不孕提供了直接針對病因的治療方法和較好的療效。2.子宮內(nèi)膜異位癥伴不孕內(nèi)膜異位癥常常伴有不孕，當(dāng)輸卵管通暢時，期待療法、促排卵或促排卵人工受精、甚至宮腹腔鏡手術(shù)處理等均為常用的治療方法。但是當(dāng)這些治療未能見效時，可以選擇IVF助孕。對III，IV期內(nèi)膜異位癥來說，在盡可能清除病灶的同時，可能造成卵巢卵細胞池的消耗，影響IVF助孕時的成功率。一項對內(nèi)異癥不孕的回顧性研究結(jié)果顯示，手術(shù)治療后9個月的妊娠率24%，而在同時期內(nèi)接受兩次IVF助孕的累計妊娠率達70%。3.男性輕度少精、弱精癥當(dāng)妻子不孕，男方精液分析呈現(xiàn)一些精液參數(shù)不正?；蚰承┲笜擞休p度下降時，經(jīng)過體外分離技術(shù)處理后，精子總數(shù)和活力可達到進行常規(guī)IVF所需要的數(shù)量，這種情況下IVF技術(shù)可作為一種治療選擇。對嚴重的少弱畸精子癥通常采用單精子卵母細胞內(nèi)注射（Intracytoplasmicsperminjection,ICSI）技術(shù)輔助受精。4.原因不明的不孕不明原因性不孕是指經(jīng)過包括腹腔鏡在內(nèi)的不孕癥病因排查仍不能找出不孕癥病因時所做的診斷。一般發(fā)生率在10%-20%，一些夫婦在診療或期待過程中成功自然受孕。不明原因多年未孕的夫婦有些會嘗試IVF助孕，雖然從整體的臨床妊娠率上看，這些夫婦與輸卵管因素不孕夫婦助孕結(jié)局無異，但其發(fā)生完全受精失敗的幾率高于輸卵管因素不孕夫婦，提示其精子或卵母細胞有潛在異常的可能性，對常規(guī)受精失敗的夫婦借助ICSI技術(shù)有望成功受精和得到可以懷孕的胚胎，說明自然受精障礙可能是部分夫婦的不孕病因。5.排卵功能障礙性不育最常見的排卵障礙是多囊卵巢綜合征（PCOS），經(jīng)過數(shù)周期成功誘導(dǎo)排卵仍未受孕或誘發(fā)排卵困難，反復(fù)促排卵失敗時，控制性卵巢刺激和IVF可作為另一個治療選擇。雖然越來越多的證據(jù)證明IVF對治療PCOS不孕的有效性，但也同時存在發(fā)生OHSS風(fēng)險大的問題，應(yīng)給予高度重視。部分PCOS婦女還存在促排卵周期卵泡發(fā)育不良的傾向，卵泡生長及緩慢或在發(fā)育過程中發(fā)生退化，這些病例可以嘗試未成熟卵體外成熟培養(yǎng)技術(shù)（Invitramaturation,IVM），從直徑在10mm以下的竇卵泡內(nèi)取出未成熟卵母細胞，經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)后行常規(guī)IVF或ICSI受精，在適應(yīng)證選擇合適，實驗室和臨床技術(shù)成熟穩(wěn)定的情況下，可期待20-30%的臨床妊娠率。６.其他因素引起的不孕IVF技術(shù)也可適用于如免疫性不孕，年齡因素引起的生育力下降，癌癥患者生育力儲備等情況。二、單精子卵母細胞內(nèi)注射（ICSI）技術(shù)適應(yīng)證對嚴重的少、弱、畸精子癥、梗阻性無精子癥、生精功能障礙造成的精液中無精子，但在睪丸活檢組織中能分離出精子的情況下，ICSI技術(shù)是行之有效的助受精技術(shù)，ICSI受精的胚胎有與自然受精形成的胚胎相似的發(fā)育潛力。嚴重少弱精癥生精障礙的男性，約10%存在染色體和性異常，對這些病例進行ICSI之前要先進行染色體核型分析。嚴重少弱精子癥精液中分離的精子，阻塞性無精子癥附睪抽吸獲得的精子，生精嚴重低下男性睪丸組織中分離出的精子均可用于ICSI，并獲得較滿意的受精率。另外，對男性免疫性不育、有常規(guī)體外受精失敗史和精子結(jié)構(gòu)異常，如無頂體或頂體功能異常等也可使用ICSI技術(shù)助受精。ICSI技術(shù)是通過顯微操作，將一條精子注射到一個成熟的卵母細胞細胞質(zhì)內(nèi)，從而輔助完成受精過程。針對男性因素不育發(fā)展的ICSI技術(shù)在生殖領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用愈來愈廣泛，其適應(yīng)證也不再僅僅局限于少弱精癥。目前，ICSI的主要適應(yīng)證有：=1\*GB3①嚴重的少、弱、畸精癥。精液中有一定數(shù)量活力及形態(tài)良好的精子是保證常規(guī)受精的前提，如果精液質(zhì)量較差，選擇ICSI是最佳治療方案，因為ICSI技術(shù)只要保證每枚成熟卵子有一條質(zhì)量較好的精子即可。=2\*GB3②不明原因的常規(guī)受精失敗史。對于既往IVF存在常規(guī)受精失敗或受精率低于20%時，當(dāng)病人再次進行IVF治療，通常建議此周期采用ICSI技術(shù)。=3\*GB3③睪丸或附睪精子。對于一些需要通過手術(shù)從睪丸或附睪中獲取的精子，ICSI技術(shù)也能幫助這些男性利用較少的精子完成受精過程。=4\*GB3④需要用PCR技術(shù)診斷的PGD周期。由于單細胞PCR技術(shù)難度大，準確性要求高，為了為避免PCR擴增時因顆粒細胞或精子導(dǎo)致的污染，針對PCR-PGD周期應(yīng)采用ICSI技術(shù)。第四節(jié)控制性促排卵與卵泡監(jiān)測常用控制性促排卵方案目前常用的控制性卵巢刺激方案分為GnRH激動劑降調(diào)節(jié)方案和GnRH拮抗劑方案。GnRH激動劑降調(diào)節(jié)方案又按照使用激動劑起始時間不同分為長方案，即前一月經(jīng)周期黃體中期開始使用降調(diào)節(jié)藥物。短方案是從同周期月經(jīng)第二天開始使用降調(diào)節(jié)藥物，直至HCG日。超短方案是從同周期月經(jīng)第二天開始使用降調(diào)節(jié)藥物，3天后停用。在月經(jīng)來潮的第二天抽血測定基礎(chǔ)FSH、LH、E、P水平，當(dāng)這些激素水平在基礎(chǔ)狀態(tài)，B超檢查卵巢內(nèi)沒有>0.8cm直徑的卵泡時，可以開始使用促性腺激素，一般劑量為每日150IU至300IU。年齡在35歲以下，B超探測卵巢中基礎(chǔ)竇卵泡較多時從低劑量開始使用，年齡在35歲以上，基礎(chǔ)竇卵泡少，基礎(chǔ)FSH升高者，采用較高劑量起始。拮抗劑方案是從月經(jīng)周期第2-3天開始每日用促性腺激素150IU-300IU，自使用促性腺激素第5-8天起，每天同時使用GnRH拮抗劑0.25mg，直至HCG日仍需要要使用。長方案：從黃體中期開始使用GnRH-a。此時由于內(nèi)源性雌二醇和黃體酮水平較高，垂體處于生理抑制狀態(tài)，此時給GnRH-a一般不會造成促性腺激素的短暫升高，但有時仍會使黃體期延長。因此,長方案是利用GnRH-a對垂體的短暫促進作用消失，垂體處于抑制狀態(tài)后，完全用外源性促性腺激素刺激卵巢。一般認為，在月經(jīng)來潮2-4天后即可開始使用促性腺激素（或血雌二醇測定證明卵巢處于抑制狀態(tài)時），直到卵泡發(fā)育成熟使用HCG日為止，HCG使用后34—36小時取卵。使用GnRH-a長方案時，需適當(dāng)增加促性腺激素的用量，每日用量為3-4支（每支75單位），可多達每日6支。另外，為能完全有計劃的安排取卵手術(shù)時間，可在用GnRH-a兩周后的任何時間開始給予促性腺激素。GnRH-a長方案是目前IVF-ET中應(yīng)用最多的促排卵方案，約占70%。短方案：從月經(jīng)周期第1-3天起使用GnRH-a，利用GnRH-a使垂體釋放內(nèi)源性促性腺激素的作用促進卵泡發(fā)育，使用2-3天后開始使用促性腺激素，注射HCG日停止使用GnRH-a。短方案可減少促性腺激素用量和使用時間，降低治療費用。但偶爾GnRH-a對前一周期黃體起到喚醒或挽救的作用，孕酮水平升高甚至形成黃體囊腫。這種情況需放棄本次周期治療。超短方案：GnRH-a開始時間與短方案相同，連續(xù)使用3天止，也有報道認為連續(xù)使用7天能更有效地抑制LH峰提前出現(xiàn)。GnRH拮抗劑方案：不需要事先降調(diào)節(jié)，促排卵周期中卵泡發(fā)育到一定大小時應(yīng)用GnRH拮抗劑抑制內(nèi)源性LH峰，避免提前排卵。近十年來拮抗劑方案因簡單方便易控，在IVF卵巢刺激方案中占到的比重越來越大。二、控制性促排卵方案中常用藥物及作用：1.降調(diào)節(jié)或拮抗內(nèi)源性LH峰的藥物：促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-agonist，GnRH-a）：GnRH-a對促性腺激素釋放激素（GnRH）受體有更高的親和力，更為持久占據(jù)大部分的受體，使垂體的促性腺激素釋放激素受體大量損失并得不到補充，因而垂體不能對內(nèi)源性或外源性的GnRH進一步發(fā)生反應(yīng)。使用GnRH-a一段時間后垂體的LH和FSH分泌顯著減少，呈藥物去垂體狀態(tài)，這種現(xiàn)象被稱為垂體的降調(diào)節(jié)。這種垂體抑制作用是可逆的，可隨停藥而恢復(fù)。在超排卵中使用GnRH-a有如下優(yōu)點：（1）抑制早發(fā)LH峰的發(fā)生，避免其對卵子的質(zhì)量的不良影響；（2）降低血漿內(nèi)的LH水平，對基礎(chǔ)LH水平增高的多囊卵巢綜合征的病人尤為合適；(3)GnRH-a用藥初期，受藥物作用影響出現(xiàn)一個短暫的血漿促性腺激素高峰，有刺激小竇卵泡生長的作用；促性腺激素釋放激素拮抗劑（GnRH-antagonist，GnRH-ant）：可與GnRH受體結(jié)合，但不產(chǎn)生信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻斷GnRH對垂體的作用。目前應(yīng)用于輔助生殖臨床的拮抗劑有Centrorelix和Ganirelix兩種。GnRH拮抗劑的作用特點是：(1)與垂體GnRH受體競爭性結(jié)合；(2)使用后立即產(chǎn)生抑制效應(yīng)，降低Gn和性激素水平；(3)它的抑制效果呈劑量依賴型；(4)停藥后垂體立刻恢復(fù)反應(yīng)性。GnRH-a或稱促性腺激素釋放激素激動劑，分為短效制劑和長效制劑，短效制劑劑量為100mg/支，一般每日一次，每次一支，連續(xù)用藥8-10天垂體達到降調(diào)水平，以后每日用藥維持至HCG日停用。長效制劑劑量為3.75mg/支，為緩釋制劑，注射１支藥維持有效血藥濃度28-30天，我國生殖領(lǐng)域用長效制劑較為普遍，并且根據(jù)經(jīng)驗常用半劑或1/3劑等作降調(diào)使用。GnRH-ant或稱拮抗劑，每支劑量25ug，從卵泡直徑10mm或13mm以后開始，每日注射一次１支拮抗劑，HCG日也要注射。２.人促性腺激素HMG和促卵泡素FSH生理狀態(tài)下，每個月經(jīng)周期卵巢中都有一批卵泡自發(fā)的進入早期發(fā)育狀態(tài)，這種卵泡的自然募集過程大約是從前一個周期的最后一周開始，所能募集的卵泡數(shù)目與卵巢中剩余的原始卵泡中的卵母細胞數(shù)成正比，后者與婦女的年齡關(guān)系密切。受藥物刺激后開始發(fā)育的卵泡數(shù)目與自然募集的卵泡數(shù)相關(guān)，這些卵泡對FSH較敏感。因此，在決定發(fā)育卵泡的數(shù)目方面，年齡比FSH的使用劑量更為重要。個體對FSH的反應(yīng)在一定時期是比較恒定的，可根據(jù)刺激周期E2峰值分為高反應(yīng)和低反應(yīng)兩種類型，高反應(yīng)者獲得卵母細胞的數(shù)目和妊娠的機會均高于低反應(yīng)者。要預(yù)測卵巢的反應(yīng)性，可在月經(jīng)初期測定血清FSH水平，如果內(nèi)源FSH水平在較高水平（大于20IU/ml），說明卵巢已處于絕經(jīng)前狀態(tài)，對促性腺激素反應(yīng)差。最初的IVF-ET是利用自然周期取卵，但每個周期只能得到一個卵。為了提高妊娠率，目前在實施IVF-ET技術(shù)時，多采用控制性卵巢刺激法獲得多個卵母細胞，使用促性腺激素釋放激素激動劑或者拮抗劑避免卵泡成熟時內(nèi)源性LH峰出現(xiàn)造成提前排卵，給予超生理劑量人類促性腺激素，使一次促排卵周期能有多個卵泡發(fā)育，獲得多個可用于受精的卵母細胞，以獲得較多可移植的胚胎。在實施控制性卵巢刺激促超排卵過程中，須每日或間斷用陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育數(shù)目、大小，同時監(jiān)測血中雌二醇水平，血或尿LH變化，以便適時調(diào)整用藥，當(dāng)雙側(cè)卵巢中有2-3個較大卵泡直徑達到18mm直徑時，確定卵泡成熟，給予5000-10000IUHCG一次性注射，HCG后36小時，發(fā)育好的卵泡中卵母細胞核成熟，此時應(yīng)該安排收獲取卵在促排卵技術(shù)用于IVF治療的最初階段，氯米芬和人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG）聯(lián)合是最常用的方案，應(yīng)用這種方案比自然周期增加了獲卵數(shù)。hMG是從絕經(jīng)后婦女尿中提取的促性腺激素，每支含有75IUFSH和75IULH。人重組促性腺激素r-FSH自1993年以后陸續(xù)開始在世界各地的IVF促排卵方案中廣泛應(yīng)用，其具有不含LH、高純度、劑量和生物活性穩(wěn)定等特點，利用基因工程工廠化生產(chǎn)，且藥品來源充足。促性腺激素給藥劑量因個體卵巢儲備狀態(tài)不同而異，對卵巢儲備好的年輕女性（30歲以下），或者有多囊樣卵巢時，日用藥劑量，特別是起始劑量應(yīng)在150IU或以下；而對年齡在38歲以上，基礎(chǔ)FSH升高卵巢儲備較差的病例，日用藥量或起始劑量可在300IU或以上。在卵泡監(jiān)測過程中如果發(fā)現(xiàn)被刺激生長的卵泡數(shù)不足或生長緩慢時，可適當(dāng)增加促性腺激素劑量，而當(dāng)刺激出的卵泡數(shù)目過多時，應(yīng)適當(dāng)減少用藥量，降低發(fā)生卵巢過度刺激綜合征的風(fēng)險。３.絨毛膜促性腺激素HCG一般來說，當(dāng)B超監(jiān)測到兩側(cè)卵巢中有3個以上卵泡達到18mm直徑以上時，提示卵泡已發(fā)育至排卵前狀態(tài)，為誘發(fā)卵泡中卵母細胞細胞核減數(shù)分裂開始，一次性注射HCG5000IU-10000IU，HCG可替代排卵前內(nèi)源性LH峰，使卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，并在用藥后36小時左右處于第二次減數(shù)分裂中期，此時的卵母細胞即稱之為成熟卵母細胞，具備了與精子結(jié)合受精的功能。在拮抗劑方案中，也可使用GnRH-a對垂體的激動作用，觸發(fā)垂體迅速大量釋放LH，誘導(dǎo)卵母細胞成熟。三、促排卵周期卵泡發(fā)育的監(jiān)測1．實時超聲觀察卵泡發(fā)育超聲觀察在監(jiān)測卵泡發(fā)育過程中起到重要作用，可同時觀察卵泡的大小和數(shù)目，特別是陰道超聲的使用大大方便了醫(yī)生和患者，具有簡單，直觀，可靠等特點。從月經(jīng)周期第8天左右開始每日或隔日觀察一次，測定并記錄發(fā)育卵泡的數(shù)目、直徑以及子宮內(nèi)膜的發(fā)育情況。在使用促性腺激素促排卵時，當(dāng)2個以上卵泡直徑達到16mm以上，可作為卵泡發(fā)育成熟的一相重要指標,此時子宮內(nèi)膜厚度至少應(yīng)在8mm以上。超聲監(jiān)測作為一種聲像學(xué)檢查，對其結(jié)果應(yīng)當(dāng)進行鑒別分析，可利用動態(tài)觀察的辦法鑒別小囊腫和發(fā)育中的卵泡，但有時小囊腫也隨月經(jīng)周期或受藥物刺激而長大，必要時結(jié)合雌二醇水平進行鑒別，也可在卵泡早期或前一周期的黃體后期做一次超聲檢查，排除小囊腫存在。2．血清雌二醇測定血清雌二醇(E2)水平取決于卵泡大小和發(fā)育卵泡的數(shù)目。隨著卵泡發(fā)育，顆粒細胞產(chǎn)生的雌激素增加，當(dāng)最大卵泡直徑達18mm，且血清雌二醇水平達到平均每個卵泡直徑15mm為500pmol時，要考慮注射HCG誘導(dǎo)排卵，E2水平達3000mIU/L以上，B超顯示多個卵泡發(fā)育時，取卵后發(fā)生嚴重的卵巢過度刺激綜合征風(fēng)險增加，需要警惕，必要時可采取全胚胎凍存措施，避免發(fā)生遲發(fā)型中重度卵巢過度刺激綜合征。第五節(jié)取卵術(shù)和精子采集一、B超引導(dǎo)下穿刺抽吸卵泡取卵超聲引導(dǎo)下行經(jīng)陰道取卵在陰道超聲探頭引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸卵泡取卵，這項技術(shù)是1983年首先由Gleicher等開始使用的。目前陰道超聲取卵已取代腹腔鏡取卵成為最常用的取卵方式。取卵時,患者采取截石位，用生理鹽水沖洗陰道或先用含碘溶液沖洗，然后再用生理鹽水沖洗。有些情況下還可在取卵術(shù)前后用抗生素預(yù)防感染。陰道取卵所使用的一般為高頻陰道探頭，（7MHz），帶有穿刺引導(dǎo)支架。穿刺針內(nèi)徑120-140um，穿刺針尖部鋒利，且在靠近針尖部經(jīng)過特別加工處理，超聲下清晰可見此處回聲增強。穿刺針沿著針導(dǎo)進入，抽吸卵泡負壓100-120mmHg，當(dāng)針尖位置在卵泡中心且隨著卵泡液吸出卵泡塌陷說明穿刺準確，旋轉(zhuǎn)針頭有助于徹底吸空卵泡，必要時可用培養(yǎng)液沖洗卵泡1-2次。一個卵泡抽吸完畢后，穿刺針可繼續(xù)向前穿刺鄰近卵泡。每次取出穿刺針后都要用培養(yǎng)液抽吸沖洗穿刺針和管道系統(tǒng)，常有卵和凝血塊存留其中。超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵具有簡便、快捷，不用全身麻醉和并發(fā)癥少等優(yōu)點，但仍有可能發(fā)生出血，器官損傷（膀胱，腸管，髂血管等），以及術(shù)后感染等危險。因此在穿刺時必須肯定該結(jié)構(gòu)是在卵巢輪廓之內(nèi)，且從三維徑線上看是球形結(jié)構(gòu)。卵巢和卵泡深藏于盆腔內(nèi)，如何在排卵前將卵取出曾經(jīng)困擾著這項技術(shù)的開展。當(dāng)已經(jīng)掌握了哺乳動物體外受精技術(shù)的Edwards教授遇到了婦科內(nèi)窺鏡技術(shù)專家Steptoe教授時，碰撞出的利用腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)取卵的火花，成就了人類歷史上的一個醫(yī)學(xué)奇跡，第一例試管嬰兒由此誕生。陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵術(shù)是目前最常用的取卵方式。取卵術(shù)前可使用鎮(zhèn)痛劑或采用靜脈麻醉讓患者在無痛苦狀態(tài)下結(jié)束穿刺取卵術(shù)。一般情況下穿刺兩側(cè)卵泡取卵可在約十分鐘內(nèi)完成，B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵術(shù)簡便易行、痛苦小、創(chuàng)傷小、易接受、可以多次進行等特點，對IVF技術(shù)的普及應(yīng)用起到了有力的推動作用。圖1陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺示意圖經(jīng)陰道超聲取卵可采用局麻和鎮(zhèn)靜劑或使用短效靜脈麻醉劑，后者必須同時開放靜脈直到取卵結(jié)束麻醉恢復(fù)后才能讓病人離院。麻醉中要密切監(jiān)測患者生命體征，盡量避免各種麻醉并發(fā)癥的發(fā)生。所謂穿刺取卵手術(shù)，實為穿刺抽吸卵泡液，抽出的卵泡內(nèi)容物送至IVF實驗室，在實體顯微鏡下從卵泡液中收集卵冠丘復(fù)合物。取卵手術(shù)前，IVF實驗室需要了解每一個病人并核對其詳細資料，書寫采卵記錄單，在患者清醒時與患者核對夫妻雙方姓名和女方出生年月日等。卵泡抽吸取卵時抽出的卵泡液為草黃色清亮液體，當(dāng)混合少量血液時變?yōu)榧t色，其中懸浮一些細胞團塊或有透明狀黏液。將卵泡液倒入圓皿中，肉眼可辨認直徑約3~5mm的透明狀黏液團，其中針尖大小的白點即為卵冠丘復(fù)合物（OCCC）。如肉眼未發(fā)現(xiàn)OCCC，需要在低倍顯微鏡下仔細辨認和尋找。由于卵母細胞很容易受到溫度、PH值以及滲透壓等變化的影響，受外界環(huán)境的變化損傷卵母細胞將呈現(xiàn)出受精障礙或影響受精后胚胎的活力，因此需要快速的將采集到的OCCC轉(zhuǎn)移至預(yù)先準備好的培養(yǎng)皿中，置于5%或6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。卵母細胞的質(zhì)量可以通過顆粒細胞、卵丘放射冠形態(tài)以及卵子的形態(tài)等方面來評估。倒置鏡下還可以觀察到不同時期卵子的特點：GV期卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)可見生殖泡，GV期的卵子不具備受精能力。MI期卵子生殖泡消失，但沒有排出第一極體，MI期卵子如能體外成熟，可以受精。MII期卵子是卵子的成熟時期，鏡下可見第一極體，此期卵子受精率高。精子采集女方取卵同時或取卵后2小時內(nèi)安排男方取精，取精前應(yīng)該需禁欲3~5天。取卵日男方手淫方式取精，精液放入“無菌無毒”的專用取精杯中。取出的精液立即傳入相應(yīng)的精子實驗室，實驗室人員要認真核對夫婦姓名后接受標本和進行精子分離處理。處理前精液在室溫下要液化30分鐘后進行處理精液。處理精液的目的是去除精漿，集中活動的精子并使之獲能。常用的精液處理方法有上游法和密度梯度離心法。處理后的精子調(diào)整好密度后，以每個卵子對應(yīng)10萬~50萬條精子的比例進行受精。對于少弱精癥患者或手術(shù)獲取精子的患者需要通過ICSI技術(shù)實施受精過程。正常精液在分離后可得到數(shù)百萬或千萬個以上活精子，可用于實施常規(guī)體外受精。嚴重少弱精患者分離出的活動精子少，需要通過單精子卵母細胞內(nèi)注射輔助受精。三、手術(shù)取精對于阻塞性無精子癥，或嚴重生精障礙可從睪丸曲細精管中分離出精子患者的，借助經(jīng)皮睪丸穿刺或附睪穿刺法取精，抽出的附睪液或睪丸組織在實驗室進行處理，分離出精子。睪丸或附睪中得到的精子一般不足以進行常規(guī)受精，需借助單精子卵母細胞內(nèi)注射受精。第六節(jié)體外受精和胚胎評估將取到的卵泡液注入培養(yǎng)皿，肉眼快速辨認含卵細胞及其外周的透明帶、放射冠的卵冠丘復(fù)合物。在解剖鏡下確認有卵細胞存在后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)已預(yù)置受精培養(yǎng)液并在CO2培養(yǎng)箱平衡過夜，找到的卵在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6小時，按每1ml受精培養(yǎng)液含有10萬左右活動精子的濃度進行受精，經(jīng)過用培養(yǎng)液洗滌離心上游等過程分離出的精子是已經(jīng)被誘導(dǎo)完成獲能過程的精子，在分離出的精子數(shù)量和質(zhì)量符合常規(guī)受精標準時，采取精子和卵混合培養(yǎng)的受精受精方式，這種方式受精更符合生理狀態(tài)下精子和卵自然選擇的過程。當(dāng)男方為嚴重少弱畸精子癥患者，或者是手術(shù)獲取的睪丸或附睪精子時，需要采取單精子卵母細胞內(nèi)注射輔助受精。另外，當(dāng)精液精子分離不滿意，或有過常規(guī)受精失敗史的夫婦，也可選擇單精子注射受精的方式。體外受精后16~18小時觀察有無原核形成，并更換卵裂期培養(yǎng)液。對于常規(guī)受精的卵子需要吹打去除顆粒細胞才能觀察到原核。正常受精可以看見卵子中有兩個相同大小的圓形結(jié)構(gòu)，即雌雄原核。同時還可以在卵周隙觀察到第二極體。近年來有學(xué)者利用原核評分評估胚胎發(fā)育潛能。在觀察受精時，通常會遇見無原核出現(xiàn)或僅見單個原核出現(xiàn)的情況，甚至有時還會有多個原核出現(xiàn)的情況。無原核出現(xiàn)或出現(xiàn)單原核的情況不一定意味著受精失敗，有可能為孤雌激活、延遲受精或者是雌雄原核出現(xiàn)不同步等情況。多精子受精后可以觀察到3個或3個以上原核，這樣的胚胎不能用于移植。目前胚胎的選擇仍然以形態(tài)學(xué)評估應(yīng)用最為廣泛。形態(tài)學(xué)特征對胚胎質(zhì)量的評價見表1。表1體外受精人早期胚胎質(zhì)量評價分級形態(tài)特征細胞碎片1分裂球大小均等，透亮無2分裂球大小不均<10%3分裂球大小不均10%~50%4分裂球大小不均>50%體外受精后胚胎在第5天時發(fā)育到囊胚期，隨著體外培養(yǎng)體系的完善，特別是專供囊胚培養(yǎng)的培養(yǎng)液的使用，囊胚培養(yǎng)和移植受到推崇，囊胚移植有利于進一步行胚胎選擇。如果有優(yōu)質(zhì)囊胚形成，囊胚移植可得到更好的臨床妊娠率，選擇性單囊胚移植更能夠在最大限度減少多胎的情況下，保持較滿意的臨床妊娠率。第七節(jié)胚胎移植（EmbryoTransfer，ET）取卵后第2-3天卵裂球期胚胎和第5-6天的囊胚期胚胎都可進行胚胎移植。囊胚移植比較符合自然受精胚胎進入子宮的時間，且在現(xiàn)有體外培養(yǎng)條件下，能發(fā)育至囊胚說明胚胎具有生命力，移植成功率高。一次移植的胚胎數(shù)以2～3枚為宜。我國相關(guān)規(guī)定，35歲以下病人，第一次接受IVF-ET治療時移植2個胚胎，年齡大或反復(fù)不成功的病例，最多移植3個胚胎。增加胚胎移植數(shù)，妊娠率雖略有增加，但多胎率卻會隨之顯著增加。為減少多胎妊娠帶來的危害，推薦選擇性單囊胚移植，有較高的妊娠率，又可以降低多胎率。在早期胚胎發(fā)育過程中，透明帶逐漸變?。粩U張的囊胚使得透明帶進一步變薄，進而突破透明帶，囊胚孵出，然后完成著床過程。透明帶結(jié)構(gòu)或者功能異常時，均會影響卵子受精和胚胎發(fā)育以及著床等過程。這種情況下可在胚胎移植前借助透明帶打孔或削薄等輔助孵化技術(shù)幫助胚胎孵出和著床。輔助孵化技術(shù)是否能幫助胚胎孵出，仍存爭議，應(yīng)嚴格把握輔助孵化適應(yīng)證。較為公認的適應(yīng)證有：高齡患者（40歲以上）、透明帶增厚、數(shù)次胚胎移植未妊娠（3次以上）的患者等。胚胎移植是用專用移植管裝載要移植的胚胎，經(jīng)陰道從宮頸口送入子宮內(nèi)的過程，提高移植者的熟練度和技巧有助于獲得更好地臨床結(jié)局，移植管進入子宮腔后釋放胚胎的位置應(yīng)在距宮底部10-15mm處，B超引導(dǎo)下移植也許有助于更準確的觀察移植位置。IVF的成功應(yīng)是獲得單胎妊娠并分娩。胚胎能否著床取決于胚胎質(zhì)量及子宮內(nèi)膜的容受性。胚胎移植的目的是將胚胎安全的運送到子宮腔內(nèi)。胚胎移植前，移植醫(yī)師和實驗室人員以及護士都要認真參與核對夫婦姓名，避免因疏忽導(dǎo)致的嚴重錯誤。將移植后剩余的分裂球期胚胎或者囊胚期可移植胚胎要進行冷凍保存，凍存胚胎的常用方法有程序冷凍和玻璃化冷凍，保存在液氮中。第八節(jié)黃體支持和妊娠隨訪一、黃體支持由于控制性促排卵抑制內(nèi)源性LH分泌，抽吸取卵術(shù)時又將一定數(shù)量的卵泡顆粒細胞帶出，以及多個卵泡發(fā)育引起的雌孕激素比值不合理等，在IVF-ET后一般都采用添加黃體酮的方法進行黃體支持。目前可供選擇的黃體酮制劑有肌注黃體酮，陰道內(nèi)使用的黃體酮凝膠或膠丸，口服黃體酮片等，使用劑量為肌注黃體酮60mg/日，或雪諾酮凝膠90mg/日。黃體支持從取卵日開始，取卵術(shù)后當(dāng)日即使用黃體酮，若該周期移植后未懷孕，在移植后2周經(jīng)過血HCG測定為陰性時可以停藥，如診斷懷孕后最好要用至移植后8-10周，無出血腹痛等，應(yīng)逐漸減量至停用。二、妊娠隨訪IVF-ET術(shù)后隨訪包括幾個方面，首先是妊娠隨訪，在移植后12-14天抽血查血中HCG水平，能診斷妊娠則要繼續(xù)用藥1-2周后復(fù)查HCG，此時HCG又一次呈現(xiàn)數(shù)倍甚至數(shù)十倍上升，移植后4周以上B超上可看到宮內(nèi)正常發(fā)育的胚胎的原始胎心管搏動，診斷為活胎宮內(nèi)妊娠。于中孕期，最好還有一次隨訪，了解妊娠進展情況，分娩后隨訪要了解分娩孕周、新生兒出生體重、身長、有無畸形等，對于孩子出生后健康狀態(tài)、智力、體能、身體發(fā)育等都應(yīng)該是IVF-ET后出生嬰兒的長期觀察隨訪項目。臨床妊娠率或分娩率是目前評估IVF-ET技術(shù)實施后是否獲得療效的最重要的指標。但是，因IVF-ET后是否能夠獲得生育子女機會在很大程度上受女方年齡，生育力儲備等因素的影響。治療后的妊娠率在年輕的預(yù)后好的病例中可期待40%-50%的活嬰率。而在年齡大、不孕原因復(fù)雜、卵巢儲備差以及存在子宮容受性差等問題的病例，雖經(jīng)過嚴格的調(diào)整治療，臨床妊娠率和獲得活嬰的機會仍然很低。雖然已經(jīng)有很大的提高，但總體來說，目前IVF-ET治療后的活嬰分娩率為25%～35%。IVF-ET后懷孕的病例中自然流產(chǎn)發(fā)生率在10%左右、而且宮外孕的風(fēng)險較大，特別是容易存在宮內(nèi)宮外合并妊娠或?qū)m外多部位妊娠等復(fù)雜情況，在妊娠隨訪檢查中，要特別謹慎。多胎妊娠是IVF-ET后又一妊娠高危因素，鑒于多胎妊娠帶給母嬰的多重危險，生殖領(lǐng)域近年來越來越多的主張進行選擇性單胚胎移植。第九章人類生育力的冷凍保存隨著生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，配子和胚胎的低溫保存技術(shù)已經(jīng)成為IVF-ET領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)之一。一、人類胚胎冷凍保存和復(fù)蘇技術(shù)IVF治療過程中，由于應(yīng)用了促排卵藥物，在一個周期內(nèi)可以獲得數(shù)個卵母細胞，受精后可以獲得數(shù)個胚胎；一次移植可以使用2~3枚胚胎，那么將剩余的胚胎凍存，可以最大程度保護患者的利益。隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)逐漸成熟，囊胚冷凍近年來發(fā)展迅速。二、人類配子及性腺組織體外保存（生殖儲備）技術(shù)精子冷凍包括精液精子冷凍、睪丸或附睪精子冷凍、睪丸組織冷凍等等。精液精子冷凍技術(shù)簡單穩(wěn)定，對于一些無精癥患者來說，在手術(shù)活檢睪丸或附睪診斷是否有生精功能的同時，可以將存在精子患者的組織或精子冷凍，待日后IVF治療時使用；這樣既減輕了患者的痛苦，又提高了這些患者的精子利用率。另外，對于一些年輕的惡性腫瘤患者在放化療前凍存精液，可以保存其生育力。卵子凍融技術(shù)是近年來生殖領(lǐng)域研究的熱點。雖然胚胎凍融技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但是一些特殊的情況例如取卵日無法獲得精子、宗教信仰問題、卵子庫建立等等均需要凍存卵子。卵子是人類最大的細胞，凍存過程中容易形成冰晶導(dǎo)致細胞損傷致使復(fù)蘇率降低。目前針對卵子的凍存主要應(yīng)用玻璃化凍存技術(shù)凍存MII期卵母細胞。卵子在凍存前需要剝除顆粒細胞。隨著腫瘤治療的進展，許多惡性腫瘤患者生存期得到了大幅度的提高。但是在惡性腫瘤治療的過程中，放化療都不可避免的會損傷性腺組織。對于男性患者來說，可以凍存精液保存其生育力，對于年輕女性腫瘤患者來說，除了可以保存卵子、胚胎，還可以凍存卵巢組織。由于凍存卵巢組織比凍存配子或胚胎復(fù)雜的多，因而目前臨床上尚未廣泛開展。參考文獻：SocietyforAssistedReproductiveTechnology.AmericanFertilitySociety.AssistedReproductivetechnologyintheUnitedStatesandCanada:1991resultsfromthesocietyforAssistedReproductiveTechnologygeneratedfromtheAmericanFertilitySocietyRegistry.FertilSteril,1993;59:956.PalermoG,JorisH,DevroeyP,etal.Pregnanciesafterintracytoplasmicinjectionofsinglespermatozoonintoanoocyte.Lancet,1992;340:17.HandysideAH,KontogianniEH,HardyK,WinstonRM.PregnanciesfrombiopsiedhumanpreimplantationembryossexedbyY-specificDNAamplification.Nature1990Apr19;344(6268):768-70.MunneS,MarquezC,MagliC,MortonP,MorrisonLScoringcriteriaforpreimplantationgeneticdiagnosisofnumericalabnormalitiesforchromosomesX,Y,13,16,18and21.MolHumReprod1998Sep;4(9):863-70.KuoHC,OgilvieCM,HandysideAH.Chromosomalmosaicismincleavage-stagehumanembryosandtheaccuracyofsingle-cellgeneticanalysis.JAssistReprodGenet1998May;15(5):276-80.ArmstrongDT.EFFECTSOFMATERNALAGEONOOCYTEDEVELOPMENTALCOMPETENCE.Theriogenology2001;55:1303-1322.TarínJJ,Pérez-AlbaláS,etal.Consequencesonoffspringofabnormalfunctioninageinggametes.HumReprod2002;6(6):532~544.TufanE