麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南

1麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南一、標(biāo)本采集（一）血標(biāo)本。用不含抗凝劑的采血管采集病例出疹后28天內(nèi)靜脈血2—3mL，標(biāo)明采集日期和病例姓名、編號，待血液凝固、血塊收縮后，1500rpm/min離心20分鐘分離血清。如沒有離心機(jī)，可在室溫或冷藏條件下放置至血清完全析出。將血清移至帶墊圈的外螺旋無菌管中，避免吸到紅血球。（二）病原學(xué)標(biāo)本。咽拭子標(biāo)本：出疹當(dāng)日至出疹后5天內(nèi)采集，越早越好。在咽喉部用無菌采樣拭子適度用力擦拭，獲得上皮細(xì)胞。將拭子放入有外螺旋蓋非滅活病毒采樣管（加抗生素）中。尿液標(biāo)本：用50mL帶螺旋蓋的無菌塑料離心管無菌收集30mL—50mL中段尿液，2000rpm/min離心5分鐘后，棄上清，沉淀用2mL標(biāo)本維持液或病毒運(yùn)輸液重懸。重懸后的標(biāo)本-70℃凍存。未經(jīng)離心的尿液不得冷凍。二、標(biāo)本運(yùn)送（一）血標(biāo)本。采集后應(yīng)盡快分離血清，分離后的血清標(biāo)本應(yīng)在2—8℃保存，并盡快運(yùn)送到麻疹風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，如7天內(nèi)不能送達(dá)的，應(yīng)于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。2（二）病原學(xué)標(biāo)本。標(biāo)本2—8℃保存，并盡快送達(dá)麻疹風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。如48小時(shí)內(nèi)不能送達(dá)的，-70℃以下保存。無-70℃保存條件者，可在-20℃保存并于1周內(nèi)送達(dá)。三、實(shí)驗(yàn)室檢測（一）血清學(xué)檢測。常用的血清學(xué)檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附（二）核酸檢測。常采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行麻疹風(fēng)疹病毒核酸檢測。1.提取核酸。常使用商品化的核酸提取試劑盒提取核酸，提取過程可手動(dòng)或使用自動(dòng)核酸提取儀提取。2.結(jié)果判定。參照試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果分析和判定。（三）基因分型。1.提取核酸。常使用商品化的核酸提取試劑盒提取核酸，提取過程可手動(dòng)或使用自動(dòng)核酸提取儀提取。2.靶基因擴(kuò)增。使用商品化的RT-PCR試劑盒進(jìn)行麻疹風(fēng)疹病毒靶基因的擴(kuò)增。3.序列測定、整理和分析。將靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，使用序列分析軟件對獲得的序列進(jìn)行剪輯，獲得靶基因序列，將其與WHO參考株進(jìn)行序列比對，獲得基因分型結(jié)果。（四）病毒分離。病原學(xué)標(biāo)本-70℃至少凍融一次，使病毒從上皮細(xì)胞釋放。取0.3mL—0.5mL標(biāo)本液接種于生長良好的單層傳代細(xì)胞系如Vero/3SLAM上，37℃吸附1小時(shí)—2小時(shí)后棄液，加入維持液，37℃培養(yǎng)，次日觀察有無細(xì)胞毒性，必要時(shí)換液。接種后每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE連續(xù)觀察7天，如果有特征性的麻疹病毒CPE出現(xiàn)，觀察至75％以上的細(xì)胞發(fā)生病變（CPE+++-70℃凍存。若無CPE，-70℃凍化3次，再盲傳1代—2代。風(fēng)疹病毒35℃分離培養(yǎng)效果更好，通常風(fēng)疹病毒在細(xì)胞上沒有明顯的CPE，可直接盲傳三代后，-70℃凍存。收獲的病毒分離物可采用