Cry2A嵌合蛋白構(gòu)建及其殺蟲(chóng)活性

Cry2A嵌合蛋白構(gòu)建及其殺蟲(chóng)活性目錄TOC\o"1-3"\h\u6590本科生畢業(yè)論文 1284141引言 7293471.1蘇云金芽孢桿菌及其應(yīng)用現(xiàn)狀 7293691.2昆蟲(chóng)對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的現(xiàn)狀 8209491.3Cry2類(lèi)毒素 9217781.4Cry類(lèi)毒素定向進(jìn)化 10280611.5本研究目的及意義 12290372材料與方法 1284692.1實(shí)驗(yàn)材料 12139542.1.1實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒 12184342.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 1385392.1.3實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 1487522.2實(shí)驗(yàn)方法 1555722.2.1Bt菌株基因組DNA提取 15170902.2.2E.coli質(zhì)粒DNA提取 1599272.2.3PCR擴(kuò)增 16294812.2.4無(wú)縫克隆表達(dá)載體構(gòu)建 18144332.2.5毒素蛋白表達(dá) 19283082.2.6生物活性測(cè)定 19275463結(jié)果與分析 20169183.1Cry2A-like毒素基因的克隆 2042623.2Cry2A-like表達(dá)分析 21160933.3Cry2A嵌合毒素的設(shè)計(jì)與克隆 22303893.3.1Cry2A嵌合毒素的設(shè)計(jì) 2259253.3.2Cry2A嵌合毒素的克隆 23285723.4Cry2A嵌合毒素的表達(dá)分析和生測(cè) 23173633.4.1Cry2A嵌合毒素的表達(dá)分析 23198453.4.2Cry2A嵌合毒素生物活性的測(cè)定 24327334討論 264923參考文獻(xiàn) 2820450致謝 29摘要：蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt）的昆蟲(chóng)特異性毒素為害蟲(chóng)防治提供了有效手段，初期應(yīng)用效果顯著。然而，隨著單一使用Bt農(nóng)藥，昆蟲(chóng)對(duì)Bt殺蟲(chóng)劑的敏感性已發(fā)生顯著變化。在海南島熱帶雨林土壤中，成功分離出一株典型芽孢桿菌Z149-5，并從中篩選并鑒定到一種新型Cry2A-like毒素。但經(jīng)生物活性測(cè)定，該毒素對(duì)小菜蛾（Plutellaxylostella）和棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpaarmigera）的殺蟲(chóng)活性并不顯著。為發(fā)掘更多新型殺蟲(chóng)基因資源或提高毒素效力，以阻止或延緩昆蟲(chóng)抗性，本研究采用cry2A-like和cry2Ab基因結(jié)構(gòu)域置換策略，構(gòu)建了兩種嵌合蛋白Cry2A-1和Cry2A-2。生物活性測(cè)定結(jié)果表明，這兩種嵌合蛋白對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性均優(yōu)于Cry2A-like毒素。本研究成功構(gòu)建的兩種嵌合殺蟲(chóng)蛋白，為Bt類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白家族增添了新成員。關(guān)鍵詞:蘇云金芽孢桿菌；Cry2A；嵌合改造；生物活性測(cè)定引言蘇云金芽孢桿菌及其應(yīng)用現(xiàn)狀蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt）是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。起初，是由日本學(xué)家石渡在病死的幼蠶發(fā)現(xiàn)Bt菌REF_Ref24056\r\h[1]，之后德國(guó)貝爾奈又在地中海粉蛾發(fā)現(xiàn)與之類(lèi)似的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)并詳細(xì)描述了該菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征，從此正式命名為“蘇云金芽孢桿菌”REF_Ref24451\r\h[2]。經(jīng)過(guò)深入研究，我們發(fā)現(xiàn)Bt菌株具備產(chǎn)生多種高效毒殺毒素的能力，這些毒素被細(xì)致劃分為內(nèi)毒素和外毒素兩大類(lèi)。外毒素特指細(xì)菌在代謝過(guò)程中釋放至細(xì)胞外部的毒素，其主要包括α-外毒素、β-外毒素和γ-外毒素。而內(nèi)毒素則主要由殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidalcrystalproteins，簡(jiǎn)稱(chēng)ICPs）和營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白（Vegetativeinsecticidalproteins，簡(jiǎn)稱(chēng)Vips）構(gòu)成REF_Ref21929\r\h[3]。這些毒素對(duì)昆蟲(chóng)和其他靶標(biāo)具有顯著的毒殺效果。Bt菌以其獨(dú)特的生物活性，被廣泛用于生物農(nóng)藥的制造，以控制多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。由于化學(xué)農(nóng)藥的濫用，導(dǎo)致部分害蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性，同時(shí)，對(duì)動(dòng)植物、人類(lèi)及其生態(tài)環(huán)境也帶來(lái)了潛在威脅。鑒于此，Bt制劑作為一種微生物殺蟲(chóng)劑，其優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)土壤環(huán)境影響較小、降低農(nóng)藥殘留、且具備長(zhǎng)期持久的殺蟲(chóng)效果，因此，受到了廣泛的關(guān)注和重視。經(jīng)過(guò)深入研究與開(kāi)發(fā)，我國(guó)在Bt生物農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)已躋身國(guó)際先進(jìn)行列。新型發(fā)酵設(shè)備的運(yùn)用以及成熟的工業(yè)發(fā)酵技術(shù)，配合多樣化的劑型，為我國(guó)Bt懸浮劑和高效價(jià)粉劑的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐，極大地推動(dòng)了Bt殺蟲(chóng)劑的商業(yè)化進(jìn)程。此外，我國(guó)還建立了基于生物測(cè)定的產(chǎn)品質(zhì)量效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)系統(tǒng)，并對(duì)助劑及貯存條件對(duì)Bt的影響進(jìn)行了深入研究，為科學(xué)篩選助劑和有效存貯提供了可靠依據(jù)REF_Ref22082\r\h[4]。在實(shí)際應(yīng)用中，Bt殺蟲(chóng)劑已在棉、糧、果蔬及林業(yè)害蟲(chóng)防治中得到廣泛應(yīng)用，并取得了顯著的防治效果REF_Ref18172\r\h[5]。這一成就的取得，不僅體現(xiàn)了我國(guó)農(nóng)業(yè)科技的進(jìn)步，也為保障農(nóng)業(yè)生態(tài)安全、減少化學(xué)農(nóng)藥殘留、保護(hù)人類(lèi)健康及生態(tài)環(huán)境作出了積極貢獻(xiàn)。Bt毒素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，不僅作為噴霧制劑使用，而且被整合到植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，用以保護(hù)玉米、棉花、大豆和馬鈴薯等農(nóng)作物免受昆蟲(chóng)侵害。據(jù)全球統(tǒng)計(jì)，目前約有12%的轉(zhuǎn)基因作物種植面積采用了經(jīng)過(guò)改良的抗蟲(chóng)性狀。隨著科研工作的持續(xù)推進(jìn)，科研人員成功地分離并鑒定了越來(lái)越多的Bt基因。這些基因所編碼的蛋白質(zhì)，包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ab2、Cry2Ae、Cry3Bb1、Cry34Ab1和Cry35Ab1等，經(jīng)過(guò)測(cè)定均展現(xiàn)出了顯著的殺蟲(chóng)活性?；谶@些發(fā)現(xiàn)，這些基因已被廣泛應(yīng)用于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)中REF_Ref25274\r\h[6]。我國(guó)自1993年成功培育出Cry1ABt抗蟲(chóng)棉以來(lái)，轉(zhuǎn)基因棉花得到了迅速推廣和應(yīng)用。至2020年，我國(guó)已先后批準(zhǔn)了表達(dá)Cry1Ab和表達(dá)Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲(chóng)蛋白的2個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米“DBN9936”和“瑞豐125”的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書(shū)。此外，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米在全球范圍內(nèi)也得到了商業(yè)化種植。1997年，美國(guó)環(huán)保署正式批準(zhǔn)了4種轉(zhuǎn)Bt基因玉米的商業(yè)化種植，包括采用cry1Ab基因的“176”、“Bt11”、“MON810”和采用cry1Ac基因的“DBT-418”REF_Ref27198\r\h[6]。這些轉(zhuǎn)基因玉米的主要防治對(duì)象均為玉米螟蟲(chóng)REF_Ref25490\r\h[7]。以及，轉(zhuǎn)cry1C基因的秈稻表現(xiàn)出顯著的外源基因高表達(dá)量和強(qiáng)抗螟蟲(chóng)性。為了進(jìn)一步提升水稻的抗蟲(chóng)性，研究團(tuán)隊(duì)以北方粳稻年種植面積紀(jì)錄品種‘空育131’為受體，運(yùn)用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以及后代系譜法進(jìn)行了精心選擇和培育。最終，成功培育出了轉(zhuǎn)cry1C基因水稻新品種‘HD1’。REF_Ref25682\r\h[8]昆蟲(chóng)對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的現(xiàn)狀Bt殺蟲(chóng)劑初期效果顯著，昆蟲(chóng)還未對(duì)Bt殺蟲(chóng)劑的敏感性發(fā)生顯著變化，但長(zhǎng)期使用導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)其抗性增強(qiáng)。自2010年以來(lái)，黃河流域和長(zhǎng)江流域棉區(qū)棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpaarmigera）對(duì)Cry1Ac的抗性水平顯著提高，平均約3倍。全球多地已報(bào)道小菜蛾（Plutellaxylostella）對(duì)多種Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白存在抗藥性。陜西田間亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）經(jīng)汰選獲得5個(gè)高抗性種群，其中Cry1F蛋白抗性種群抗性倍數(shù)近2000倍。不同地理種群二化螟（Chilosuppressalis）對(duì)Cry1Ab和Cry1Ca毒素敏感性差異較小。隨著長(zhǎng)期使用Bt殺蟲(chóng)劑，必然會(huì)存在昆蟲(chóng)抗性進(jìn)化的隱患。REF_Ref25855\r\h[9]關(guān)于昆蟲(chóng)抗性機(jī)制的形成，研究者普遍認(rèn)為，這主要是由于Bt殺蟲(chóng)蛋白在昆蟲(chóng)中腸內(nèi)的酶解、特異性結(jié)合等反應(yīng)發(fā)生了變化。據(jù)Zhang等人的研究，抗性品系的甜菜夜蛾中腸缺乏類(lèi)胰蛋白酶，這導(dǎo)致活化毒素的減少，進(jìn)而削弱了Bt蛋白對(duì)昆蟲(chóng)的毒性。此外，一系列研究揭示，昆蟲(chóng)抗性品系的突變能夠影響其中腸內(nèi)的鈣粘蛋白排列。鈣粘蛋白基因的突變與煙芽夜蛾、煙草天蛾、棉鈴蟲(chóng)等對(duì)Cry1Ac的抗性有著密切的聯(lián)系REF_Ref26048\r\h[10]。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解昆蟲(chóng)抗性的形成機(jī)制提供了新的思路。農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑和轉(zhuǎn)基因植物的抗性進(jìn)化是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)，影響了防治效果，可能導(dǎo)致害蟲(chóng)數(shù)量反彈，威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。為減緩昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑和轉(zhuǎn)Bt基因植物的抗性進(jìn)化，可采取多種措施延緩昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。首先，減少殺蟲(chóng)劑使用頻率是關(guān)鍵，降低昆蟲(chóng)抗性水平。其次，為應(yīng)對(duì)害蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題，我們必須實(shí)施輪換或混合使用不同作用機(jī)制的殺蟲(chóng)劑策略，以確保害蟲(chóng)不會(huì)對(duì)單一藥劑產(chǎn)生抗性。此外，我們還應(yīng)積極推廣合理使用增效劑，以增強(qiáng)殺蟲(chóng)劑的效果，并有效抑制昆蟲(chóng)抗性的發(fā)展。除了化學(xué)防治，微生物殺蟲(chóng)劑也重要，與環(huán)境友好且不易引起抗性?；蚬こ谈脑觳《净蚪M和提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲(chóng)能力也是潛在防治手段。實(shí)施“高劑量/庇護(hù)所”策略和RNAi技術(shù)與Bt毒素協(xié)同抗蟲(chóng)也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。綜上所述，針對(duì)昆蟲(chóng)抗性進(jìn)化的挑戰(zhàn)，我們應(yīng)采取一系列綜合措施。首先，要減少不必要和過(guò)量的殺蟲(chóng)劑使用，以降低害蟲(chóng)對(duì)藥劑的依賴(lài)性和抗性風(fēng)險(xiǎn)。其次，要定期輪換使用不同類(lèi)型的殺蟲(chóng)劑，避免害蟲(chóng)對(duì)某一藥劑產(chǎn)生適應(yīng)性。同時(shí)，我們還應(yīng)積極探索和推廣微生物殺蟲(chóng)劑等環(huán)保型防治手段，以減少對(duì)環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞。此外，我們還應(yīng)加強(qiáng)科研力度，推動(dòng)基因工程改造和雙價(jià)或多價(jià)轉(zhuǎn)基因植物抗蟲(chóng)技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用。同時(shí)，實(shí)施“高劑量/庇護(hù)所”策略和RNAi技術(shù)與Bt毒素協(xié)同抗蟲(chóng)等創(chuàng)新方法，以提高防治效果和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的安全性。通過(guò)這些綜合措施的實(shí)施，我們將能夠有效應(yīng)對(duì)昆蟲(chóng)抗性進(jìn)化的問(wèn)題，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的順利進(jìn)行，并為農(nóng)民增產(chǎn)增收提供有力支持。Cry2類(lèi)毒素Cry2類(lèi)毒素是一個(gè)龐大的家族，涵蓋了12個(gè)亞群（Cry2Aa至Cry2Ak，以及Cry2Bb）。這些毒素蛋白的大小約為70kDa，展現(xiàn)出高度相似的序列結(jié)構(gòu)，但在殺蟲(chóng)特異性和殺蟲(chóng)譜方面卻表現(xiàn)出顯著的差異性。值得一提的是，其中的某些毒素對(duì)鱗翅目和雙翅目幼蟲(chóng)具有雙重活性REF_Ref26290\r\h[10]。在2017年，Shu等人對(duì)Cry2類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白的各個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了深入的聚類(lèi)分析。他們發(fā)現(xiàn)，不同蛋白間在區(qū)域相似性上存在差異，并且結(jié)構(gòu)域I對(duì)Cry2類(lèi)蛋白的殺蟲(chóng)特異性起到了至關(guān)重要的作用。REF_Ref26290\r\h[11]。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，Cry2類(lèi)蛋白與目前廣泛用于防治鱗翅目害蟲(chóng)的Cry1A，Vip3A蛋白在棉鈴蟲(chóng)中腸不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，它們之間不存在交互抗性，因此Cry2類(lèi)蛋白是昆蟲(chóng)抗性治理的重要候選蛋白。REF_Ref26290\r\h[11]Cry2Aa，Cry2Ac，Cry2Ag等Cry2類(lèi)蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)和雙翅目昆蟲(chóng)均具有殺蟲(chóng)活性。李海濤首次報(bào)道了Cry2Aa對(duì)直翅目昆蟲(chóng)黃脛小車(chē)蝗的毒殺作用。Semih等人發(fā)現(xiàn)Cry2Aa18對(duì)雙翅目害蟲(chóng)尖音庫(kù)蚊有高毒力，可控制其傳播的傳染病。Cry2Ag1對(duì)埃及伊蚊、小菜蛾和棉鈴蟲(chóng)均有活性REF_Ref26290\r\h[11]。Zhang等人從苔鮮植物中分離的Cry2Ac5對(duì)白紋伊蚊有活性。Saleem等人發(fā)現(xiàn)Cry2Ac7對(duì)棉鈴蟲(chóng)和家蠅有殺蟲(chóng)活性，這是Cry2Ac對(duì)棉鈴蟲(chóng)的首次報(bào)道。而Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Ae、Cry2Af、Cry2Ah和Cry2A1僅對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)有活性，如Cry2Af2對(duì)棉鈴蟲(chóng)有活性，Cry2A11對(duì)斜紋夜蛾和棉鈴蟲(chóng)有活性，但對(duì)埃及伊蚊無(wú)活性。Lin等人發(fā)現(xiàn)Cry2Ab10對(duì)小菜蛾有高毒力REF_Ref26437\r\h[12]。Cry2Ah1對(duì)亞洲玉米螟有體重抑制活性，并對(duì)棉鈴蟲(chóng)品系有生長(zhǎng)抑制活性REF_Ref26531\r\h[13]。將cry2Ah1基因轉(zhuǎn)到煙草中，對(duì)棉鈴蟲(chóng)表現(xiàn)出高抗活性，表明植物中表達(dá)的Cry2Ah1蛋白具有正常殺蟲(chóng)活性。經(jīng)過(guò)昆蟲(chóng)攝取后，Cry蛋白與中腸受體蛋白結(jié)合，其中包括鈣粘素和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，這是實(shí)現(xiàn)其殺蟲(chóng)作用的關(guān)鍵步驟。由于昆蟲(chóng)腸道的堿性PH和還原條件，昆蟲(chóng)攝入的Cry殺蟲(chóng)蛋白晶體包裹體會(huì)在腸腔中溶解，進(jìn)而激活的Cry蛋白與位于中腸細(xì)胞微絨毛的鈣粘蛋白受體結(jié)合。這一結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂和細(xì)胞死亡，最終使得目標(biāo)昆蟲(chóng)的腸道活動(dòng)喪失，直至昆蟲(chóng)癱瘓并最終死亡。值得注意的是，大多數(shù)的Cry蛋白在自然狀態(tài)下是以非活性的原毒素形式存在的，這些原毒素會(huì)在某些昆蟲(chóng)的中腸蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)化為活性毒素。這種轉(zhuǎn)化過(guò)程似乎是一系列連續(xù)的蛋白水解裂解反應(yīng)，從C末端開(kāi)始，逐步向N末端進(jìn)行，直至生成蛋白酶穩(wěn)定的毒素。REF_Ref26711\r\h[14]關(guān)于Cry毒素的作用機(jī)制，部分學(xué)者認(rèn)為其膜穿孔模型與激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路緊密相關(guān)。他們認(rèn)為，穿孔后細(xì)胞膜可能因滲透壓升高而破裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)激活的信號(hào)通路也可能引發(fā)細(xì)胞凋亡。這一觀(guān)點(diǎn)強(qiáng)調(diào)膜穿孔與信號(hào)通路激活的并存與相互促進(jìn)作用。此外，還有學(xué)者提出昆蟲(chóng)對(duì)體內(nèi)毒素異物存在免疫應(yīng)激反應(yīng)，這一過(guò)程可能與殺蟲(chóng)作用相關(guān)。盡管研究人員對(duì)殺蟲(chóng)機(jī)制存在不同猜想，但截至目前，膜穿孔假說(shuō)仍是最被廣泛接受的殺蟲(chóng)機(jī)制。REF_Ref26815\r\h[15]Cry類(lèi)毒素定向進(jìn)化隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，昆蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題日益凸顯，成為了制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。尤其是對(duì)于那些以Cry殺蟲(chóng)蛋白為主要防治手段的靶標(biāo)昆蟲(chóng)，一旦它們產(chǎn)生抗性，便會(huì)使這種防治手段失去效果。因此，探索和研究新的策略來(lái)應(yīng)對(duì)昆蟲(chóng)抗藥性，顯得尤為迫切。一種有效的策略是對(duì)Cry毒素進(jìn)行截短。通過(guò)去除毒素中的某些部分，可以使其對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)的毒性增強(qiáng)，同時(shí)降低對(duì)非靶標(biāo)生物的影響。除了截短，嵌合改造也是一種有效的策略。通過(guò)將不同來(lái)源的Cry毒素進(jìn)行嵌合，可以創(chuàng)造出具有新型殺蟲(chóng)活性的毒素。這種策略不僅可以拓寬Cry毒素的宿主范圍，還可以提高其對(duì)某些特定昆蟲(chóng)的毒性。定點(diǎn)突變是另一種值得關(guān)注的策略。通過(guò)定點(diǎn)改變Cry毒素的氨基酸序列，可以精確地調(diào)控其殺蟲(chóng)活性和宿主范圍。這種策略不僅可以避免對(duì)整個(gè)毒素進(jìn)行大規(guī)模的改造，還可以更加精準(zhǔn)地滿(mǎn)足農(nóng)業(yè)防治的需求。此外，篩選具有增強(qiáng)活性的突變毒素也是一種重要的策略。通過(guò)利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，科學(xué)家們可以在大量突變毒素中篩選出具有更高殺蟲(chóng)活性的突變體。這些突變體不僅可以提高Cry毒素的防治效果，還可以延長(zhǎng)其使用壽命，降低抗藥性的發(fā)生概率REF_Ref2590\r\h[16]。綜上所述，針對(duì)昆蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題，可以采取截短、嵌合改造、定點(diǎn)突變和篩選具有增強(qiáng)活性的突變毒素等策略來(lái)改進(jìn)Cry毒素。這些策略不僅可以提高Cry毒素的殺蟲(chóng)活性和宿主范圍，還可以降低對(duì)非靶標(biāo)生物的影響，從而更加有效地防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。鑒于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)對(duì)Bt毒素產(chǎn)生的抗性日益增強(qiáng)，對(duì)Cry毒素進(jìn)行人工改造以提升其對(duì)特定害蟲(chóng)的毒性，從而有效地殺滅新的靶標(biāo)昆蟲(chóng)，顯得尤為關(guān)鍵和重要。Cry毒素間的結(jié)構(gòu)域交換，作為一種古老卻仍具潛力的方法，被用于改造具有獨(dú)特特性的毒素。此類(lèi)大型結(jié)構(gòu)域交換不僅證實(shí)了交換片段的功能性，還為毒素結(jié)合和宿主特異性研究提供了新的視角。Cry毒素間的結(jié)構(gòu)域III交換揭示了該結(jié)構(gòu)域在毒素與宿主互作中的關(guān)鍵作用。因此，3DCry毒素的結(jié)構(gòu)域III成為了結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)的首選。值得一提的是，通過(guò)成功將Cry1Ia的結(jié)構(gòu)域II轉(zhuǎn)移到Cry1Ba，成功開(kāi)發(fā)出了一種對(duì)十二月乳桿菌具有顯著活性的新型毒素。此外，3DCry1毒素間的結(jié)構(gòu)域III交換已被證明能夠有效提升對(duì)特定害蟲(chóng)的毒性，并擴(kuò)展至與原始毒素關(guān)系較遠(yuǎn)的3DCry毒素。一般而言，將一種Bt毒素的結(jié)構(gòu)域III完全或部分替換為另一種毒素的結(jié)構(gòu)域，能夠使受體毒素獲得供體毒素的特異性REF_Ref2590\r\h[16]。為了深入了解Cry2A類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白的殺蟲(chóng)機(jī)制，進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)調(diào)研和實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)對(duì)比分析不同Cry2A類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)其殺蟲(chóng)活性與特定的結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)。因此，通過(guò)交換結(jié)構(gòu)域嵌合改造Cry2A-like，有望獲得具有更高殺蟲(chóng)活性的新型生物殺蟲(chóng)劑。然而，關(guān)于Cry2A類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白的研究報(bào)道相對(duì)較少，這在一定程度上限制了其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，本研究旨在通過(guò)交換結(jié)構(gòu)域嵌合改造Cry2A-like，以期發(fā)現(xiàn)更具潛力的生物殺蟲(chóng)劑。本研究目的及意義隨著全球?qū)r(nóng)業(yè)可持續(xù)性的日益關(guān)注，生物技術(shù)在農(nóng)作物保護(hù)方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。其中，Cry殺蟲(chóng)蛋白因其對(duì)特定昆蟲(chóng)的高效、環(huán)保殺蟲(chóng)效果而備受青睞。然而，Cry蛋白的毒性限制和宿主范圍問(wèn)題一直是制約其應(yīng)用的瓶頸。近年來(lái)，對(duì)Cry殺蟲(chóng)蛋白的研究層出不窮。眾多學(xué)者致力于通過(guò)基因工程手段對(duì)Cry蛋白進(jìn)行改造，以提高其殺蟲(chóng)效果和拓寬應(yīng)用范圍。本研究針對(duì)Cry2A殺蟲(chóng)蛋白進(jìn)行了深入的結(jié)構(gòu)域交換與修飾研究，旨在克服當(dāng)前存在的問(wèn)題，提高其對(duì)特定靶標(biāo)昆蟲(chóng)的毒性效力。通過(guò)結(jié)構(gòu)域交換，成功地將Cry2A殺蟲(chóng)蛋白的關(guān)鍵功能區(qū)域與其他相關(guān)蛋白進(jìn)行交換，從而產(chǎn)生了具有全新結(jié)構(gòu)和功能的雜交蛋白。本研究不僅為Cry2類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白增添了新的成員，也為未來(lái)的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治提供了新的策略和手段。材料與方法實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒本研究涉及的具體菌株與質(zhì)粒見(jiàn)表2.1。Bt菌株Z149-5從海南島熱帶原始雨林土壤篩選分離獲得。芽孢桿菌在肉湯培養(yǎng)基（BrothMedium,LB）培養(yǎng)基。質(zhì)粒pET-28a與pET-30a為大腸桿菌表達(dá)載體，均帶有Kan抗性基因和6×His標(biāo)簽，選用了E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）分別作為克隆和表達(dá)的宿主菌，在37℃條件下LB中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)精心培育，所有細(xì)菌均達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨后與15%濃度的甘油進(jìn)行均勻混合。為確保其活性與穩(wěn)定性，建議在-20℃或-80℃的低溫環(huán)境下進(jìn)行長(zhǎng)期保存。表2.1菌株與質(zhì)粒特征菌株或質(zhì)粒特征描述來(lái)源Z149-5BacillusthuringiensisLabstockSW41-2BacillusthuringiensisLabstockE.coliDH5αR-,M-,AmpRLabstockE.coliBL2(DE3)F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3)LabstockpET-28aKanR,His?Tag/thrombin/T7?TagNovagen實(shí)驗(yàn)試劑主要試劑配置方法見(jiàn)表2.2。表2.2主要試劑配置方法實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備主要儀器見(jiàn)表2.3。表2.3主要儀器及設(shè)備儀器設(shè)備名稱(chēng)生產(chǎn)廠(chǎng)家型號(hào)高壓蒸汽滅菌鍋致微廈門(mén)儀器有限公司GR85DA恒溫振蕩培養(yǎng)箱上海智城儀器制造有限公司ZWY-211B轉(zhuǎn)移電泳槽北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY-ZY6雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器TU-1901PCR儀德國(guó)耶拿分析儀器股份公司Blockassembly96G通用電泳儀北京君意東方設(shè)備有限公司JY200C小型冷凍高速離心機(jī)ThermoFisherScientificFresco21生化培養(yǎng)箱韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司LRH-150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海力辰儀器科技有限公司HSP-70BE凝膠成像儀BIO-RAD721BR08616垂直電泳槽北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY-SCZ2+型漩渦混合器RATEKVM1恒溫金屬浴博日CHB-202大型冷凍高速離心力康發(fā)展有限公司Neofuge23R超聲波破碎儀美國(guó)Sonics公司VCX800蛋白質(zhì)凝膠掃描儀BIO-RADGS-800實(shí)驗(yàn)方法Bt菌株基因組DNA提取在無(wú)菌環(huán)境下，使用無(wú)菌牙簽從Bt菌體中取樣，并將其接種于新鮮LB培養(yǎng)基中。將接種后的培養(yǎng)基置于28℃恒溫條件下，進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。待菌體充分生長(zhǎng)后，采用氯仿-酚抽提法提取Bt菌體的總DNA。該方法主要步驟包括見(jiàn)圖2.2。圖2.2主要步驟E.coli質(zhì)粒DNA提取利用生工（SangonBiotech）的SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，可以精確地從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA。該方法主要步驟包括見(jiàn)圖2.3。圖2.3主要步驟PCR擴(kuò)增以細(xì)菌基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出所需的目的基因。所有必需的引物序列已在表中詳細(xì)列出，在擴(kuò)增該基因的兩端引物時(shí)，需在其前端增加15~25bp的與載體插入位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，以確?；蚰軌蛘_插入到載體中。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，為確定最佳的退火溫度，我們?cè)O(shè)置了溫度梯度進(jìn)行條件優(yōu)化。一旦找到最佳條件，便使用這些條件進(jìn)行大規(guī)模的目的片段擴(kuò)增。同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一對(duì)反向擴(kuò)增引物，用于線(xiàn)性化pET-28a載體。通過(guò)PCR方法實(shí)現(xiàn)載體的線(xiàn)性化后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并利用DpnI酶去除甲基化模板質(zhì)粒，以避免在后續(xù)無(wú)縫克隆操作中產(chǎn)生不必要的干擾。完成去除甲基化模板質(zhì)粒的純化步驟后，得到的產(chǎn)物即可用于后續(xù)的無(wú)縫克隆操作。表2.4引物序列信息引物名稱(chēng)引物序列長(zhǎng)度P2_190-FcagcaaatggtcgcggatccATGGATAGTGTATTGAATAGCGGAAG1914bpP2_190-RgtggtggtggtggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGAAC2AbNM-FcagcaaatgggtcgcggatccATGAATAGTGTATTGAATAGCGGAAGA1284bp2AbC-RgtggtggtggtggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGTACAFX86NM-FcagcaaatgggtcgcggatccATGGATAGTGTATTGAATAGCGGAAG1284bpFX86C-RgggggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGAACpET-28-FCTCGAGCACCACCACCACC5600bppET-28-RGGATCCGCGACCCATTTG表2.5PCR反應(yīng)體系試劑劑量2×TaqMasterMix12.5μLPrimers（F/R10nM）1μL總DNA0.5μLAddwaterto25μL表2.6PCR反應(yīng)的條件溫度時(shí)間預(yù)變性95℃5min變性95℃1min退火55℃2min延伸72℃3min再延伸72℃5min保存4℃30min注：按照1Kb/min的擴(kuò)增效率設(shè)置不同的延伸時(shí)間，變性、退火、延伸循環(huán)30次。無(wú)縫克隆表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)諾唯贊無(wú)縫克隆試劑盒的說(shuō)明書(shū)，將目的基因與載體進(jìn)行連接。經(jīng)過(guò)分析，選擇特定的酶切位點(diǎn)，以構(gòu)建線(xiàn)性化載體。這一過(guò)程中，采用了Cry2A-like作為示例，詳細(xì)的酶切體系如表2.7所示。為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，特別選用了XhoⅠ和BamHI作為酶切工具。該方法主要步驟包括見(jiàn)圖2.4。圖2.4主要步驟表2.7酶切反應(yīng)體系ComponentVolumeOBuffer10μL載體40μLBamHI5μLXhoⅠ5μLddH2O40μLTotal100μL表2.8連接反應(yīng)體系ComponentVolume目的基因XμLpET30a線(xiàn)型化載體YμL5xCEIIBuffer4μLExnaseII2μLAddwaterto20μL毒素蛋白表達(dá)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們已成功將克隆子轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）表達(dá)菌株內(nèi)。為確保轉(zhuǎn)化操作的有效性，我們從轉(zhuǎn)化后的菌落中隨機(jī)選擇了若干單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并對(duì)通過(guò)驗(yàn)證的菌落實(shí)施了活化。隨后，我們采用兩種不同溫度（16℃與28℃）和兩種IPTG濃度（0.05mM與1mM）的組合條件進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，我們收集了各組實(shí)驗(yàn)條件下的菌體，利用PBS緩沖液進(jìn)行了洗滌。之后，我們采用超聲波對(duì)菌體進(jìn)行了破碎處理，具體操作為每次破碎5秒，間隔5秒，全程共計(jì)10分鐘。破碎后，以12000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行了30分鐘的離心，實(shí)現(xiàn)了上清液與沉淀的分離。接下來(lái)，我們分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行了樣品處理，即添加5×SDSLoadingBuffer，均勻混合后，置于沸水中加熱5分鐘，隨后以12000rpm的速度離心10分鐘。最終，我們利用SDS電泳分析結(jié)果，確定了最優(yōu)的表達(dá)條件。生物活性測(cè)定將特定量的飼料進(jìn)行精確稱(chēng)重后，放入已消毒的塑料袋中并徹底碾碎。隨后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的蛋白質(zhì)量，精確計(jì)算并加入到已碾碎的飼料中。確?；旌暇鶆蚝螅骄峙渲烈淮涡缘臒o(wú)菌醬料盒中。待飼料稍微晾干后，選擇大約二齡的鱗翅目昆蟲(chóng)加入，每個(gè)濃度組包含約10頭幼蟲(chóng)。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需設(shè)置三個(gè)重復(fù)組，并重復(fù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程三次。同時(shí)，以清水作為空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。對(duì)于定性實(shí)驗(yàn)，需要記錄從第1天至第7天的昆蟲(chóng)死亡數(shù)量。之后，利用GraphPadprism7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲取有關(guān)昆蟲(chóng)死亡情況的詳細(xì)信息。對(duì)于定量實(shí)驗(yàn)，蛋白樣品需進(jìn)行7個(gè)或8個(gè)梯度的稀釋?zhuān)♂尩臐舛忍荻确謩e為1、3/4、2/4、1/4、1/8、1/16、1/32和1/64。記錄第5天或第7天的死亡數(shù)和抑制數(shù)。結(jié)果與分析Cry2A-like毒素基因的克隆從海南島熱帶雨林成功分離出了一株新型的Bt菌株，并將其命名為Z149-5。接著，進(jìn)行了初步的基因組測(cè)序與分析工作，結(jié)果揭示出該菌株內(nèi)存在一個(gè)與Cry2A毒素基因高度相似的基因，將其命名為Cry2A-like。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將Z149-5菌株置于28℃的條件下進(jìn)行了一夜的活化處理，并隨后成功地提取了總DNA。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，所提取的Bt總DNA條帶的大小與預(yù)期相符，且基本上未觀(guān)察到雜帶的干擾，這為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，提供了有力的物質(zhì)支持。基于對(duì)BtZ149-5基因組開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)結(jié)果，精心設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，即P2_190-F/R，旨在擴(kuò)增目標(biāo)基因Cry2A-like。以Z149-5的總DNA作為模板，成功執(zhí)行了PCR擴(kuò)增。此外，為構(gòu)建重組質(zhì)粒，選用pET-28a質(zhì)粒作為模板，并運(yùn)用特定位點(diǎn)反向擴(kuò)增引物進(jìn)行了PCR線(xiàn)性化操作。經(jīng)過(guò)梯度退火溫度的測(cè)試，最終確定了65℃為Cry2A-like毒素基因擴(kuò)增的最佳退火溫度。在該實(shí)驗(yàn)條件下，我們進(jìn)行了大規(guī)模的擴(kuò)增操作，隨后采用柱式PCR產(chǎn)物純化技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了精細(xì)處理，以確保為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供高純度的DNA模板。依據(jù)吐露港公司的操作指南，我們采用2×EzmaxUniversalCloneMix試劑，順利實(shí)現(xiàn)了純化的Cry2A-like毒素基因片段與線(xiàn)性化pET-28a載體的無(wú)縫克隆連接。隨后，我們?nèi)〕隽?0μL的連接反應(yīng)產(chǎn)物，成功地將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。之后，我們隨機(jī)選擇了單個(gè)菌落進(jìn)行了整夜的活化處理。在接下來(lái)的日子里，我們成功地從活化后的菌落中提取了質(zhì)粒，并利用BamHI和XhoI雙酶切技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，所有被檢測(cè)的單個(gè)克隆子均成功實(shí)現(xiàn)了連接。圖3.1Z149-5基因組、Cry2A-like基因梯度PCR、質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證注：圖A為Z149-5總DNA提取，圖B為Cry2A-like基因不同溫度梯度結(jié)果，泳道1~8分別為65℃、64.3℃、63℃、61.1℃、58.8℃、56.9℃、55.7℃、55℃。圖C為經(jīng)過(guò)整夜活化后的單克隆所提取質(zhì)粒，在經(jīng)過(guò)XhoI和BamHI雙酶處理后的切割結(jié)果。Cry2A-like表達(dá)分析經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的確認(rèn)，克隆子已被成功導(dǎo)入BL21(DE3)表達(dá)菌株中。之后，我們從轉(zhuǎn)化后的菌落中隨機(jī)選擇了單個(gè)菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，確保其活化成功。緊接著，我們?cè)趦煞N不同的溫度環(huán)境（16℃與28℃）下，分別采用0.05mM和1mM的IPTG濃度對(duì)菌落進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，我們收集了在不同實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)菌樣本，并用PBS緩沖液對(duì)其進(jìn)行了洗滌。然后，我們運(yùn)用超聲波技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了細(xì)胞破碎，整個(gè)破碎過(guò)程持續(xù)10分鐘，期間采用每破碎5秒后暫停5秒的方式循環(huán)進(jìn)行。破碎工作完成后，通過(guò)12000rpm離心30分鐘，成功分離了上清液與沉淀。對(duì)上清液和沉淀進(jìn)行了備樣處理，加入5×SDSLoadingBuffer后充分混勻，并在沸水中蒸煮5分鐘。再次以12000rpm離心10分鐘后，進(jìn)行了SDS電泳分析，以確定最佳的表達(dá)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在16℃、0.05mMIPTG條件下，成功表達(dá)出了大量可溶性蛋白，其中編碼完整基因的表達(dá)產(chǎn)物分子量約為71.3kDa。圖3.2Cry2A-like各條件下表達(dá)SDS電泳圖示注：M:三色預(yù)染蛋白Marker;泳道1為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導(dǎo)上清；泳道2為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導(dǎo)沉淀；泳道3-4：分別為0.05mMIPTG在16℃、20h上清液及沉淀；泳道5-6：分別0.1mMIPTG在16℃、20h上清液及沉淀；泳道7-8：分別為0.05mMIPTG在28℃、20h上清液及沉淀；泳道9-10：分別為0.1mMIPTG在28℃、20h上清液及沉淀。Cry2A嵌合毒素的設(shè)計(jì)與克隆Cry2A嵌合毒素的設(shè)計(jì)Cry2A-like為實(shí)驗(yàn)室自主分離鑒定的一個(gè)新型毒素蛋白，但經(jīng)生物活性測(cè)定，該毒素對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性并不顯著。提高毒素效力以阻止或延緩昆蟲(chóng)抗性。在研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Cry2A-like與Cry2Ab的N端結(jié)構(gòu)域相同，但M端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域差別很大。因此，本研究采用置換M端結(jié)構(gòu)域策略來(lái)增強(qiáng)殺蟲(chóng)蛋白對(duì)昆蟲(chóng)的毒素效力，獲取Cry2A-like與Cry2Ab的三個(gè)結(jié)構(gòu)域的目的片段，通過(guò)無(wú)縫克隆交換結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了兩種嵌合蛋白Cry2A-1和Cry2A-2。圖3.3Cry2Ab和Cry2A-like毒素蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行置換Cry2A嵌合毒素的克隆為滿(mǎn)足無(wú)縫克隆的技術(shù)要求，我們精心設(shè)計(jì)了合適的引物并成功合成。以提取的總DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，我們成功擴(kuò)增得到了Cry2Ab和Cry2A-like基因的目標(biāo)DNA片段。同時(shí)，我們也從表達(dá)載體pET-3中順利提取了質(zhì)粒，并通過(guò)雙酶切技術(shù)獲得了線(xiàn)性化的載體。隨后，我們將線(xiàn)性化的pET-28a載體與Cry2Ab及Cry2A-like基因片段分別進(jìn)行了無(wú)縫克隆連接，并成功地將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入了BL21(DE3)菌株中。為了確認(rèn)陽(yáng)性克隆子的構(gòu)建是否正確，我們綜合運(yùn)用了PCR、酶切分析以及DNA測(cè)序等多種方法進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖展示，清晰地證明了Cry2Ab和Cry2A-like目標(biāo)片段的成功擴(kuò)增。更進(jìn)一步的驗(yàn)證，包括表達(dá)子PCR、酶切分析以及測(cè)序結(jié)果，均顯示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)期相符，且未發(fā)現(xiàn)任何特異性突變。因此，可以確信已經(jīng)成功地構(gòu)建了Cry2Ab和Cry2A-likeBL21(DE3)表達(dá)工程菌株，為后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。圖3.4Cry2Ab和Cry2A-like目的片段PCR注：M:三色預(yù)染蛋白Marker;泳道1~6分別為2A1-1、2A1-2、2A1-3、2A2-1、2A2-2、2A2-3片段Cry2A嵌合毒素的表達(dá)分析和生測(cè)Cry2A嵌合毒素的表達(dá)分析經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)與構(gòu)建，嵌合基因已成功導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)。為了進(jìn)一步優(yōu)化蛋白表達(dá)條件，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，涵蓋了不同溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等多個(gè)變量。經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，成功實(shí)現(xiàn)了Cry2A-1和Cry2A-2嵌合基因的異源表達(dá)。通過(guò)詳細(xì)的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為16℃、IPTG濃度為0.1mM、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為20h時(shí)，蛋白表達(dá)效果達(dá)到最佳狀態(tài)。低濃度的IPTG能夠有效調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)速度，有助于蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確折疊，進(jìn)而減少包涵體蛋白質(zhì)的形成，提升重組蛋白的可溶性表達(dá)REF_Ref25241\r\h[17]。圖3.5Cry2A-1和Cry2A-2雙酶切驗(yàn)證、表達(dá)SDS電泳圖示注：M:三色預(yù)染蛋白Marker;左圖泳道依次分別為Cry2A-1和Cry2A-2雙酶切驗(yàn)證圖；右圖為Cry2A-1和Cry2A-2在0.1mMIPTG在16℃誘導(dǎo)表達(dá)20h條件下表達(dá)SDS電泳圖；泳道1為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導(dǎo)上清；泳道2為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導(dǎo)沉淀；泳道3：Cry2A-1上清液；泳道4：Cry2A-1沉淀；泳道5：Cry2A-2上清液；Cry2A-2沉淀Cry2A嵌合毒素生物活性的測(cè)定除此之外，為了進(jìn)一步評(píng)估可溶性毒素蛋白Cry2A-like的生物活性，還對(duì)棉鈴蟲(chóng)和小菜蛾進(jìn)行了定性的生物活性測(cè)定，將成功表達(dá)的嵌合蛋白進(jìn)行室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定。經(jīng)過(guò)定性實(shí)驗(yàn)，記錄從第1天至第7天的昆蟲(chóng)死亡數(shù)量。對(duì)于所收集的生測(cè)數(shù)據(jù)，采用了GraphPadprism7軟件進(jìn)行了深入的分析。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，Cry2A-1與Cry2A-2對(duì)于所測(cè)試小菜蛾幼蟲(chóng)展現(xiàn)出明顯的殺蟲(chóng)活性，然而未對(duì)棉鈴蟲(chóng)展現(xiàn)出明顯的殺蟲(chóng)活性。但是經(jīng)過(guò)嵌合改造后，Cry2A-1、Cry2A-2明顯均對(duì)所測(cè)試棉鈴蟲(chóng)、小菜蛾幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)毒性效力增高。圖3.5生物活性測(cè)定討論經(jīng)深入探究，Cry2類(lèi)毒素作為Bt殺蟲(chóng)毒素，具備高序列相似性，但在殺蟲(chóng)特異性和殺蟲(chóng)譜方面存在顯著差異。特別值得一提的是，部分Cry2類(lèi)毒素對(duì)鱗翅目和雙翅目幼蟲(chóng)均展現(xiàn)雙重活性。據(jù)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cry2類(lèi)蛋白與廣泛運(yùn)用于防治鱗翅目害蟲(chóng)的Cry1A、Vip3A蛋白在棉鈴蟲(chóng)中腸并不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，這意味著它們之間不存在交互抗性。因此，Cry2類(lèi)蛋白被視為昆蟲(chóng)抗性治理的重要候選蛋白。為了更全面地理解Cry2A類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白的作用機(jī)制，我們進(jìn)行了系統(tǒng)的文獻(xiàn)回顧和實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)過(guò)對(duì)比分析不同Cry2A類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，我們發(fā)現(xiàn)其殺蟲(chóng)活性與某些特定結(jié)構(gòu)域緊密相連?；诖耍ㄟ^(guò)結(jié)構(gòu)域交換和嵌合改造Cry2A-like，有望開(kāi)發(fā)出具有更高殺蟲(chóng)活性的新型生物殺蟲(chóng)劑。然而，目前關(guān)于Cry2A類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白的研究報(bào)道尚顯不足，這在一定程度上限制了其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。本研究致力于通過(guò)結(jié)構(gòu)域交換和修飾，對(duì)Cry2A殺蟲(chóng)蛋白進(jìn)行深入研究，旨在解決現(xiàn)有問(wèn)題，提高其對(duì)特定靶標(biāo)昆蟲(chóng)的毒性效力。經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)域交換，我們成功地將Cry2A殺蟲(chóng)蛋白的關(guān)鍵功能區(qū)域與其