Cry2A嵌合蛋白構(gòu)建及其殺蟲活性

Cry2A嵌合蛋白構(gòu)建及其殺蟲活性目錄TOC\o"1-3"\h\u6590本科生畢業(yè)論文 1284141引言 7293471.1蘇云金芽孢桿菌及其應(yīng)用現(xiàn)狀 7293691.2昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性的現(xiàn)狀 8209491.3Cry2類毒素 9217781.4Cry類毒素定向進化 10280611.5本研究目的及意義 12290372材料與方法 1284692.1實驗材料 12139542.1.1實驗菌株與質(zhì)粒 12184342.1.2實驗試劑 1385392.1.3實驗儀器及設(shè)備 1487522.2實驗方法 1555722.2.1Bt菌株基因組DNA提取 15170902.2.2E.coli質(zhì)粒DNA提取 1599272.2.3PCR擴增 16294812.2.4無縫克隆表達載體構(gòu)建 18144332.2.5毒素蛋白表達 19283082.2.6生物活性測定 19275463結(jié)果與分析 20169183.1Cry2A-like毒素基因的克隆 2042623.2Cry2A-like表達分析 21160933.3Cry2A嵌合毒素的設(shè)計與克隆 22303893.3.1Cry2A嵌合毒素的設(shè)計 2259253.3.2Cry2A嵌合毒素的克隆 23285723.4Cry2A嵌合毒素的表達分析和生測 23173633.4.1Cry2A嵌合毒素的表達分析 23198453.4.2Cry2A嵌合毒素生物活性的測定 24327334討論 264923參考文獻 2820450致謝 29摘要：蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱Bt）的昆蟲特異性毒素為害蟲防治提供了有效手段，初期應(yīng)用效果顯著。然而，隨著單一使用Bt農(nóng)藥，昆蟲對Bt殺蟲劑的敏感性已發(fā)生顯著變化。在海南島熱帶雨林土壤中，成功分離出一株典型芽孢桿菌Z149-5，并從中篩選并鑒定到一種新型Cry2A-like毒素。但經(jīng)生物活性測定，該毒素對小菜蛾（Plutellaxylostella）和棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）的殺蟲活性并不顯著。為發(fā)掘更多新型殺蟲基因資源或提高毒素效力，以阻止或延緩昆蟲抗性，本研究采用cry2A-like和cry2Ab基因結(jié)構(gòu)域置換策略，構(gòu)建了兩種嵌合蛋白Cry2A-1和Cry2A-2。生物活性測定結(jié)果表明，這兩種嵌合蛋白對小菜蛾和棉鈴蟲的殺蟲活性均優(yōu)于Cry2A-like毒素。本研究成功構(gòu)建的兩種嵌合殺蟲蛋白，為Bt類殺蟲蛋白家族增添了新成員。關(guān)鍵詞:蘇云金芽孢桿菌；Cry2A；嵌合改造；生物活性測定引言蘇云金芽孢桿菌及其應(yīng)用現(xiàn)狀蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱Bt）是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陽性桿菌。起初，是由日本學家石渡在病死的幼蠶發(fā)現(xiàn)Bt菌REF_Ref24056\r\h[1]，之后德國貝爾奈又在地中海粉蛾發(fā)現(xiàn)與之類似的細菌，發(fā)現(xiàn)并詳細描述了該菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征，從此正式命名為“蘇云金芽孢桿菌”REF_Ref24451\r\h[2]。經(jīng)過深入研究，我們發(fā)現(xiàn)Bt菌株具備產(chǎn)生多種高效毒殺毒素的能力，這些毒素被細致劃分為內(nèi)毒素和外毒素兩大類。外毒素特指細菌在代謝過程中釋放至細胞外部的毒素，其主要包括α-外毒素、β-外毒素和γ-外毒素。而內(nèi)毒素則主要由殺蟲晶體蛋白（Insecticidalcrystalproteins，簡稱ICPs）和營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetativeinsecticidalproteins，簡稱Vips）構(gòu)成REF_Ref21929\r\h[3]。這些毒素對昆蟲和其他靶標具有顯著的毒殺效果。Bt菌以其獨特的生物活性，被廣泛用于生物農(nóng)藥的制造，以控制多種農(nóng)業(yè)害蟲。由于化學農(nóng)藥的濫用，導致部分害蟲產(chǎn)生了抗藥性，同時，對動植物、人類及其生態(tài)環(huán)境也帶來了潛在威脅。鑒于此，Bt制劑作為一種微生物殺蟲劑，其優(yōu)點在于對土壤環(huán)境影響較小、降低農(nóng)藥殘留、且具備長期持久的殺蟲效果，因此，受到了廣泛的關(guān)注和重視。經(jīng)過深入研究與開發(fā)，我國在Bt生物農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)已躋身國際先進行列。新型發(fā)酵設(shè)備的運用以及成熟的工業(yè)發(fā)酵技術(shù)，配合多樣化的劑型，為我國Bt懸浮劑和高效價粉劑的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供了堅實的技術(shù)支撐，極大地推動了Bt殺蟲劑的商業(yè)化進程。此外，我國還建立了基于生物測定的產(chǎn)品質(zhì)量效價標準化技術(shù)系統(tǒng)，并對助劑及貯存條件對Bt的影響進行了深入研究，為科學篩選助劑和有效存貯提供了可靠依據(jù)REF_Ref22082\r\h[4]。在實際應(yīng)用中，Bt殺蟲劑已在棉、糧、果蔬及林業(yè)害蟲防治中得到廣泛應(yīng)用，并取得了顯著的防治效果REF_Ref18172\r\h[5]。這一成就的取得，不僅體現(xiàn)了我國農(nóng)業(yè)科技的進步，也為保障農(nóng)業(yè)生態(tài)安全、減少化學農(nóng)藥殘留、保護人類健康及生態(tài)環(huán)境作出了積極貢獻。Bt毒素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，不僅作為噴霧制劑使用，而且被整合到植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，用以保護玉米、棉花、大豆和馬鈴薯等農(nóng)作物免受昆蟲侵害。據(jù)全球統(tǒng)計，目前約有12%的轉(zhuǎn)基因作物種植面積采用了經(jīng)過改良的抗蟲性狀。隨著科研工作的持續(xù)推進，科研人員成功地分離并鑒定了越來越多的Bt基因。這些基因所編碼的蛋白質(zhì)，包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ab2、Cry2Ae、Cry3Bb1、Cry34Ab1和Cry35Ab1等，經(jīng)過測定均展現(xiàn)出了顯著的殺蟲活性?；谶@些發(fā)現(xiàn)，這些基因已被廣泛應(yīng)用于抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)中REF_Ref25274\r\h[6]。我國自1993年成功培育出Cry1ABt抗蟲棉以來，轉(zhuǎn)基因棉花得到了迅速推廣和應(yīng)用。至2020年，我國已先后批準了表達Cry1Ab和表達Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白的2個轉(zhuǎn)基因玉米“DBN9936”和“瑞豐125”的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書。此外，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米在全球范圍內(nèi)也得到了商業(yè)化種植。1997年，美國環(huán)保署正式批準了4種轉(zhuǎn)Bt基因玉米的商業(yè)化種植，包括采用cry1Ab基因的“176”、“Bt11”、“MON810”和采用cry1Ac基因的“DBT-418”REF_Ref27198\r\h[6]。這些轉(zhuǎn)基因玉米的主要防治對象均為玉米螟蟲REF_Ref25490\r\h[7]。以及，轉(zhuǎn)cry1C基因的秈稻表現(xiàn)出顯著的外源基因高表達量和強抗螟蟲性。為了進一步提升水稻的抗蟲性，研究團隊以北方粳稻年種植面積紀錄品種‘空育131’為受體，運用根瘤農(nóng)桿菌介導法以及后代系譜法進行了精心選擇和培育。最終，成功培育出了轉(zhuǎn)cry1C基因水稻新品種‘HD1’。REF_Ref25682\r\h[8]昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性的現(xiàn)狀Bt殺蟲劑初期效果顯著，昆蟲還未對Bt殺蟲劑的敏感性發(fā)生顯著變化，但長期使用導致昆蟲對其抗性增強。自2010年以來，黃河流域和長江流域棉區(qū)棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）對Cry1Ac的抗性水平顯著提高，平均約3倍。全球多地已報道小菜蛾（Plutellaxylostella）對多種Bt殺蟲晶體蛋白存在抗藥性。陜西田間亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）經(jīng)汰選獲得5個高抗性種群，其中Cry1F蛋白抗性種群抗性倍數(shù)近2000倍。不同地理種群二化螟（Chilosuppressalis）對Cry1Ab和Cry1Ca毒素敏感性差異較小。隨著長期使用Bt殺蟲劑，必然會存在昆蟲抗性進化的隱患。REF_Ref25855\r\h[9]關(guān)于昆蟲抗性機制的形成，研究者普遍認為，這主要是由于Bt殺蟲蛋白在昆蟲中腸內(nèi)的酶解、特異性結(jié)合等反應(yīng)發(fā)生了變化。據(jù)Zhang等人的研究，抗性品系的甜菜夜蛾中腸缺乏類胰蛋白酶，這導致活化毒素的減少，進而削弱了Bt蛋白對昆蟲的毒性。此外，一系列研究揭示，昆蟲抗性品系的突變能夠影響其中腸內(nèi)的鈣粘蛋白排列。鈣粘蛋白基因的突變與煙芽夜蛾、煙草天蛾、棉鈴蟲等對Cry1Ac的抗性有著密切的聯(lián)系REF_Ref26048\r\h[10]。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解昆蟲抗性的形成機制提供了新的思路。農(nóng)業(yè)害蟲對殺蟲劑和轉(zhuǎn)基因植物的抗性進化是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)，影響了防治效果，可能導致害蟲數(shù)量反彈，威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。為減緩昆蟲對殺蟲劑和轉(zhuǎn)Bt基因植物的抗性進化，可采取多種措施延緩昆蟲產(chǎn)生抗性。首先，減少殺蟲劑使用頻率是關(guān)鍵，降低昆蟲抗性水平。其次，為應(yīng)對害蟲抗藥性問題，我們必須實施輪換或混合使用不同作用機制的殺蟲劑策略，以確保害蟲不會對單一藥劑產(chǎn)生抗性。此外，我們還應(yīng)積極推廣合理使用增效劑，以增強殺蟲劑的效果，并有效抑制昆蟲抗性的發(fā)展。除了化學防治，微生物殺蟲劑也重要，與環(huán)境友好且不易引起抗性。基因工程改造病毒基因組和提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲能力也是潛在防治手段。實施“高劑量/庇護所”策略和RNAi技術(shù)與Bt毒素協(xié)同抗蟲也是當前研究的熱點。綜上所述，針對昆蟲抗性進化的挑戰(zhàn)，我們應(yīng)采取一系列綜合措施。首先，要減少不必要和過量的殺蟲劑使用，以降低害蟲對藥劑的依賴性和抗性風險。其次，要定期輪換使用不同類型的殺蟲劑，避免害蟲對某一藥劑產(chǎn)生適應(yīng)性。同時，我們還應(yīng)積極探索和推廣微生物殺蟲劑等環(huán)保型防治手段，以減少對環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞。此外，我們還應(yīng)加強科研力度，推動基因工程改造和雙價或多價轉(zhuǎn)基因植物抗蟲技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用。同時，實施“高劑量/庇護所”策略和RNAi技術(shù)與Bt毒素協(xié)同抗蟲等創(chuàng)新方法，以提高防治效果和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的安全性。通過這些綜合措施的實施，我們將能夠有效應(yīng)對昆蟲抗性進化的問題，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的順利進行，并為農(nóng)民增產(chǎn)增收提供有力支持。Cry2類毒素Cry2類毒素是一個龐大的家族，涵蓋了12個亞群（Cry2Aa至Cry2Ak，以及Cry2Bb）。這些毒素蛋白的大小約為70kDa，展現(xiàn)出高度相似的序列結(jié)構(gòu)，但在殺蟲特異性和殺蟲譜方面卻表現(xiàn)出顯著的差異性。值得一提的是，其中的某些毒素對鱗翅目和雙翅目幼蟲具有雙重活性REF_Ref26290\r\h[10]。在2017年，Shu等人對Cry2類殺蟲蛋白的各個結(jié)構(gòu)域進行了深入的聚類分析。他們發(fā)現(xiàn)，不同蛋白間在區(qū)域相似性上存在差異，并且結(jié)構(gòu)域I對Cry2類蛋白的殺蟲特異性起到了至關(guān)重要的作用。REF_Ref26290\r\h[11]。競爭結(jié)合實驗表明，Cry2類蛋白與目前廣泛用于防治鱗翅目害蟲的Cry1A，Vip3A蛋白在棉鈴蟲中腸不競爭結(jié)合位點，它們之間不存在交互抗性，因此Cry2類蛋白是昆蟲抗性治理的重要候選蛋白。REF_Ref26290\r\h[11]Cry2Aa，Cry2Ac，Cry2Ag等Cry2類蛋白對鱗翅目昆蟲和雙翅目昆蟲均具有殺蟲活性。李海濤首次報道了Cry2Aa對直翅目昆蟲黃脛小車蝗的毒殺作用。Semih等人發(fā)現(xiàn)Cry2Aa18對雙翅目害蟲尖音庫蚊有高毒力，可控制其傳播的傳染病。Cry2Ag1對埃及伊蚊、小菜蛾和棉鈴蟲均有活性REF_Ref26290\r\h[11]。Zhang等人從苔鮮植物中分離的Cry2Ac5對白紋伊蚊有活性。Saleem等人發(fā)現(xiàn)Cry2Ac7對棉鈴蟲和家蠅有殺蟲活性，這是Cry2Ac對棉鈴蟲的首次報道。而Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Ae、Cry2Af、Cry2Ah和Cry2A1僅對鱗翅目害蟲有活性，如Cry2Af2對棉鈴蟲有活性，Cry2A11對斜紋夜蛾和棉鈴蟲有活性，但對埃及伊蚊無活性。Lin等人發(fā)現(xiàn)Cry2Ab10對小菜蛾有高毒力REF_Ref26437\r\h[12]。Cry2Ah1對亞洲玉米螟有體重抑制活性，并對棉鈴蟲品系有生長抑制活性REF_Ref26531\r\h[13]。將cry2Ah1基因轉(zhuǎn)到煙草中，對棉鈴蟲表現(xiàn)出高抗活性，表明植物中表達的Cry2Ah1蛋白具有正常殺蟲活性。經(jīng)過昆蟲攝取后，Cry蛋白與中腸受體蛋白結(jié)合，其中包括鈣粘素和ABC轉(zhuǎn)運蛋白等，這是實現(xiàn)其殺蟲作用的關(guān)鍵步驟。由于昆蟲腸道的堿性PH和還原條件，昆蟲攝入的Cry殺蟲蛋白晶體包裹體會在腸腔中溶解，進而激活的Cry蛋白與位于中腸細胞微絨毛的鈣粘蛋白受體結(jié)合。這一結(jié)合會導致細胞分裂和細胞死亡，最終使得目標昆蟲的腸道活動喪失，直至昆蟲癱瘓并最終死亡。值得注意的是，大多數(shù)的Cry蛋白在自然狀態(tài)下是以非活性的原毒素形式存在的，這些原毒素會在某些昆蟲的中腸蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)化為活性毒素。這種轉(zhuǎn)化過程似乎是一系列連續(xù)的蛋白水解裂解反應(yīng)，從C末端開始，逐步向N末端進行，直至生成蛋白酶穩(wěn)定的毒素。REF_Ref26711\r\h[14]關(guān)于Cry毒素的作用機制，部分學者認為其膜穿孔模型與激活細胞內(nèi)的信號通路緊密相關(guān)。他們認為，穿孔后細胞膜可能因滲透壓升高而破裂，導致細胞死亡，同時激活的信號通路也可能引發(fā)細胞凋亡。這一觀點強調(diào)膜穿孔與信號通路激活的并存與相互促進作用。此外，還有學者提出昆蟲對體內(nèi)毒素異物存在免疫應(yīng)激反應(yīng)，這一過程可能與殺蟲作用相關(guān)。盡管研究人員對殺蟲機制存在不同猜想，但截至目前，膜穿孔假說仍是最被廣泛接受的殺蟲機制。REF_Ref26815\r\h[15]Cry類毒素定向進化隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，昆蟲抗藥性問題日益凸顯，成為了制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。尤其是對于那些以Cry殺蟲蛋白為主要防治手段的靶標昆蟲，一旦它們產(chǎn)生抗性，便會使這種防治手段失去效果。因此，探索和研究新的策略來應(yīng)對昆蟲抗藥性，顯得尤為迫切。一種有效的策略是對Cry毒素進行截短。通過去除毒素中的某些部分，可以使其對靶標昆蟲的毒性增強，同時降低對非靶標生物的影響。除了截短，嵌合改造也是一種有效的策略。通過將不同來源的Cry毒素進行嵌合，可以創(chuàng)造出具有新型殺蟲活性的毒素。這種策略不僅可以拓寬Cry毒素的宿主范圍，還可以提高其對某些特定昆蟲的毒性。定點突變是另一種值得關(guān)注的策略。通過定點改變Cry毒素的氨基酸序列，可以精確地調(diào)控其殺蟲活性和宿主范圍。這種策略不僅可以避免對整個毒素進行大規(guī)模的改造，還可以更加精準地滿足農(nóng)業(yè)防治的需求。此外，篩選具有增強活性的突變毒素也是一種重要的策略。通過利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，科學家們可以在大量突變毒素中篩選出具有更高殺蟲活性的突變體。這些突變體不僅可以提高Cry毒素的防治效果，還可以延長其使用壽命，降低抗藥性的發(fā)生概率REF_Ref2590\r\h[16]。綜上所述，針對昆蟲抗藥性問題，可以采取截短、嵌合改造、定點突變和篩選具有增強活性的突變毒素等策略來改進Cry毒素。這些策略不僅可以提高Cry毒素的殺蟲活性和宿主范圍，還可以降低對非靶標生物的影響，從而更加有效地防治農(nóng)業(yè)害蟲。鑒于農(nóng)業(yè)害蟲對Bt毒素產(chǎn)生的抗性日益增強，對Cry毒素進行人工改造以提升其對特定害蟲的毒性，從而有效地殺滅新的靶標昆蟲，顯得尤為關(guān)鍵和重要。Cry毒素間的結(jié)構(gòu)域交換，作為一種古老卻仍具潛力的方法，被用于改造具有獨特特性的毒素。此類大型結(jié)構(gòu)域交換不僅證實了交換片段的功能性，還為毒素結(jié)合和宿主特異性研究提供了新的視角。Cry毒素間的結(jié)構(gòu)域III交換揭示了該結(jié)構(gòu)域在毒素與宿主互作中的關(guān)鍵作用。因此，3DCry毒素的結(jié)構(gòu)域III成為了結(jié)構(gòu)域交換實驗的首選。值得一提的是，通過成功將Cry1Ia的結(jié)構(gòu)域II轉(zhuǎn)移到Cry1Ba，成功開發(fā)出了一種對十二月乳桿菌具有顯著活性的新型毒素。此外，3DCry1毒素間的結(jié)構(gòu)域III交換已被證明能夠有效提升對特定害蟲的毒性，并擴展至與原始毒素關(guān)系較遠的3DCry毒素。一般而言，將一種Bt毒素的結(jié)構(gòu)域III完全或部分替換為另一種毒素的結(jié)構(gòu)域，能夠使受體毒素獲得供體毒素的特異性REF_Ref2590\r\h[16]。為了深入了解Cry2A類殺蟲蛋白的殺蟲機制，進行了大量的文獻調(diào)研和實驗研究。通過對比分析不同Cry2A類殺蟲蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)其殺蟲活性與特定的結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)。因此，通過交換結(jié)構(gòu)域嵌合改造Cry2A-like，有望獲得具有更高殺蟲活性的新型生物殺蟲劑。然而，關(guān)于Cry2A類殺蟲蛋白的研究報道相對較少，這在一定程度上限制了其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，本研究旨在通過交換結(jié)構(gòu)域嵌合改造Cry2A-like，以期發(fā)現(xiàn)更具潛力的生物殺蟲劑。本研究目的及意義隨著全球?qū)r(nóng)業(yè)可持續(xù)性的日益關(guān)注，生物技術(shù)在農(nóng)作物保護方面發(fā)揮著越來越重要的作用。其中，Cry殺蟲蛋白因其對特定昆蟲的高效、環(huán)保殺蟲效果而備受青睞。然而，Cry蛋白的毒性限制和宿主范圍問題一直是制約其應(yīng)用的瓶頸。近年來，對Cry殺蟲蛋白的研究層出不窮。眾多學者致力于通過基因工程手段對Cry蛋白進行改造，以提高其殺蟲效果和拓寬應(yīng)用范圍。本研究針對Cry2A殺蟲蛋白進行了深入的結(jié)構(gòu)域交換與修飾研究，旨在克服當前存在的問題，提高其對特定靶標昆蟲的毒性效力。通過結(jié)構(gòu)域交換，成功地將Cry2A殺蟲蛋白的關(guān)鍵功能區(qū)域與其他相關(guān)蛋白進行交換，從而產(chǎn)生了具有全新結(jié)構(gòu)和功能的雜交蛋白。本研究不僅為Cry2類殺蟲蛋白增添了新的成員，也為未來的農(nóng)業(yè)害蟲防治提供了新的策略和手段。材料與方法實驗材料實驗菌株與質(zhì)粒本研究涉及的具體菌株與質(zhì)粒見表2.1。Bt菌株Z149-5從海南島熱帶原始雨林土壤篩選分離獲得。芽孢桿菌在肉湯培養(yǎng)基（BrothMedium,LB）培養(yǎng)基。質(zhì)粒pET-28a與pET-30a為大腸桿菌表達載體，均帶有Kan抗性基因和6×His標簽，選用了E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）分別作為克隆和表達的宿主菌，在37℃條件下LB中培養(yǎng)。經(jīng)過精心培育，所有細菌均達到對數(shù)生長期，隨后與15%濃度的甘油進行均勻混合。為確保其活性與穩(wěn)定性，建議在-20℃或-80℃的低溫環(huán)境下進行長期保存。表2.1菌株與質(zhì)粒特征菌株或質(zhì)粒特征描述來源Z149-5BacillusthuringiensisLabstockSW41-2BacillusthuringiensisLabstockE.coliDH5αR-,M-,AmpRLabstockE.coliBL2(DE3)F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3)LabstockpET-28aKanR,His?Tag/thrombin/T7?TagNovagen實驗試劑主要試劑配置方法見表2.2。表2.2主要試劑配置方法實驗儀器及設(shè)備主要儀器見表2.3。表2.3主要儀器及設(shè)備儀器設(shè)備名稱生產(chǎn)廠家型號高壓蒸汽滅菌鍋致微廈門儀器有限公司GR85DA恒溫振蕩培養(yǎng)箱上海智城儀器制造有限公司ZWY-211B轉(zhuǎn)移電泳槽北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY-ZY6雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器TU-1901PCR儀德國耶拿分析儀器股份公司Blockassembly96G通用電泳儀北京君意東方設(shè)備有限公司JY200C小型冷凍高速離心機ThermoFisherScientificFresco21生化培養(yǎng)箱韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司LRH-150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海力辰儀器科技有限公司HSP-70BE凝膠成像儀BIO-RAD721BR08616垂直電泳槽北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY-SCZ2+型漩渦混合器RATEKVM1恒溫金屬浴博日CHB-202大型冷凍高速離心力康發(fā)展有限公司Neofuge23R超聲波破碎儀美國Sonics公司VCX800蛋白質(zhì)凝膠掃描儀BIO-RADGS-800實驗方法Bt菌株基因組DNA提取在無菌環(huán)境下，使用無菌牙簽從Bt菌體中取樣，并將其接種于新鮮LB培養(yǎng)基中。將接種后的培養(yǎng)基置于28℃恒溫條件下，進行過夜培養(yǎng)。待菌體充分生長后，采用氯仿-酚抽提法提取Bt菌體的總DNA。該方法主要步驟包括見圖2.2。圖2.2主要步驟E.coli質(zhì)粒DNA提取利用生工（SangonBiotech）的SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，可以精確地從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA。該方法主要步驟包括見圖2.3。圖2.3主要步驟PCR擴增以細菌基因組DNA為模板，運用PCR技術(shù)擴增出所需的目的基因。所有必需的引物序列已在表中詳細列出，在擴增該基因的兩端引物時，需在其前端增加15~25bp的與載體插入位點互補的序列，以確保基因能夠正確插入到載體中。在PCR擴增過程中，為確定最佳的退火溫度，我們設(shè)置了溫度梯度進行條件優(yōu)化。一旦找到最佳條件，便使用這些條件進行大規(guī)模的目的片段擴增。同時，我們設(shè)計了一對反向擴增引物，用于線性化pET-28a載體。通過PCR方法實現(xiàn)載體的線性化后，對PCR產(chǎn)物進行純化，并利用DpnI酶去除甲基化模板質(zhì)粒，以避免在后續(xù)無縫克隆操作中產(chǎn)生不必要的干擾。完成去除甲基化模板質(zhì)粒的純化步驟后，得到的產(chǎn)物即可用于后續(xù)的無縫克隆操作。表2.4引物序列信息引物名稱引物序列長度P2_190-FcagcaaatggtcgcggatccATGGATAGTGTATTGAATAGCGGAAG1914bpP2_190-RgtggtggtggtggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGAAC2AbNM-FcagcaaatgggtcgcggatccATGAATAGTGTATTGAATAGCGGAAGA1284bp2AbC-RgtggtggtggtggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGTACAFX86NM-FcagcaaatgggtcgcggatccATGGATAGTGTATTGAATAGCGGAAG1284bpFX86C-RgggggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGAACpET-28-FCTCGAGCACCACCACCACC5600bppET-28-RGGATCCGCGACCCATTTG表2.5PCR反應(yīng)體系試劑劑量2×TaqMasterMix12.5μLPrimers（F/R10nM）1μL總DNA0.5μLAddwaterto25μL表2.6PCR反應(yīng)的條件溫度時間預(yù)變性95℃5min變性95℃1min退火55℃2min延伸72℃3min再延伸72℃5min保存4℃30min注：按照1Kb/min的擴增效率設(shè)置不同的延伸時間，變性、退火、延伸循環(huán)30次。無縫克隆表達載體構(gòu)建根據(jù)諾唯贊無縫克隆試劑盒的說明書，將目的基因與載體進行連接。經(jīng)過分析，選擇特定的酶切位點，以構(gòu)建線性化載體。這一過程中，采用了Cry2A-like作為示例，詳細的酶切體系如表2.7所示。為了確保實驗的準確性和穩(wěn)定性，特別選用了XhoⅠ和BamHI作為酶切工具。該方法主要步驟包括見圖2.4。圖2.4主要步驟表2.7酶切反應(yīng)體系ComponentVolumeOBuffer10μL載體40μLBamHI5μLXhoⅠ5μLddH2O40μLTotal100μL表2.8連接反應(yīng)體系ComponentVolume目的基因XμLpET30a線型化載體YμL5xCEIIBuffer4μLExnaseII2μLAddwaterto20μL毒素蛋白表達經(jīng)過實驗驗證，我們已成功將克隆子轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）表達菌株內(nèi)。為確保轉(zhuǎn)化操作的有效性，我們從轉(zhuǎn)化后的菌落中隨機選擇了若干單菌落進行PCR驗證，并對通過驗證的菌落實施了活化。隨后，我們采用兩種不同溫度（16℃與28℃）和兩種IPTG濃度（0.05mM與1mM）的組合條件進行了誘導表達實驗。在誘導表達結(jié)束后，我們收集了各組實驗條件下的菌體，利用PBS緩沖液進行了洗滌。之后，我們采用超聲波對菌體進行了破碎處理，具體操作為每次破碎5秒，間隔5秒，全程共計10分鐘。破碎后，以12000rpm的轉(zhuǎn)速進行了30分鐘的離心，實現(xiàn)了上清液與沉淀的分離。接下來，我們分別對上清和沉淀進行了樣品處理，即添加5×SDSLoadingBuffer，均勻混合后，置于沸水中加熱5分鐘，隨后以12000rpm的速度離心10分鐘。最終，我們利用SDS電泳分析結(jié)果，確定了最優(yōu)的表達條件。生物活性測定將特定量的飼料進行精確稱重后，放入已消毒的塑料袋中并徹底碾碎。隨后，根據(jù)實驗所需的蛋白質(zhì)量，精確計算并加入到已碾碎的飼料中。確?；旌暇鶆蚝螅骄峙渲烈淮涡缘臒o菌醬料盒中。待飼料稍微晾干后，選擇大約二齡的鱗翅目昆蟲加入，每個濃度組包含約10頭幼蟲。為確保實驗結(jié)果的準確性，需設(shè)置三個重復組，并重復整個實驗過程三次。同時，以清水作為空白對照組進行對照實驗。對于定性實驗，需要記錄從第1天至第7天的昆蟲死亡數(shù)量。之后，利用GraphPadprism7軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以獲取有關(guān)昆蟲死亡情況的詳細信息。對于定量實驗，蛋白樣品需進行7個或8個梯度的稀釋，稀釋的濃度梯度分別為1、3/4、2/4、1/4、1/8、1/16、1/32和1/64。記錄第5天或第7天的死亡數(shù)和抑制數(shù)。結(jié)果與分析Cry2A-like毒素基因的克隆從海南島熱帶雨林成功分離出了一株新型的Bt菌株，并將其命名為Z149-5。接著，進行了初步的基因組測序與分析工作，結(jié)果揭示出該菌株內(nèi)存在一個與Cry2A毒素基因高度相似的基因，將其命名為Cry2A-like。為了確保實驗結(jié)果的準確性，將Z149-5菌株置于28℃的條件下進行了一夜的活化處理，并隨后成功地提取了總DNA。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，所提取的Bt總DNA條帶的大小與預(yù)期相符，且基本上未觀察到雜帶的干擾，這為后續(xù)的實驗操作奠定了堅實的基礎(chǔ)，提供了有力的物質(zhì)支持?；趯tZ149-5基因組開放閱讀框的預(yù)測結(jié)果，精心設(shè)計了一對特異性引物，即P2_190-F/R，旨在擴增目標基因Cry2A-like。以Z149-5的總DNA作為模板，成功執(zhí)行了PCR擴增。此外，為構(gòu)建重組質(zhì)粒，選用pET-28a質(zhì)粒作為模板，并運用特定位點反向擴增引物進行了PCR線性化操作。經(jīng)過梯度退火溫度的測試，最終確定了65℃為Cry2A-like毒素基因擴增的最佳退火溫度。在該實驗條件下，我們進行了大規(guī)模的擴增操作，隨后采用柱式PCR產(chǎn)物純化技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行了精細處理，以確保為后續(xù)實驗研究提供高純度的DNA模板。依據(jù)吐露港公司的操作指南，我們采用2×EzmaxUniversalCloneMix試劑，順利實現(xiàn)了純化的Cry2A-like毒素基因片段與線性化pET-28a載體的無縫克隆連接。隨后，我們?nèi)〕隽?0μL的連接反應(yīng)產(chǎn)物，成功地將其轉(zhuǎn)導到DH5α化學感受態(tài)細胞中。之后，我們隨機選擇了單個菌落進行了整夜的活化處理。在接下來的日子里，我們成功地從活化后的菌落中提取了質(zhì)粒，并利用BamHI和XhoI雙酶切技術(shù)對其進行了有效性驗證。實驗數(shù)據(jù)顯示，所有被檢測的單個克隆子均成功實現(xiàn)了連接。圖3.1Z149-5基因組、Cry2A-like基因梯度PCR、質(zhì)粒雙酶切驗證注：圖A為Z149-5總DNA提取，圖B為Cry2A-like基因不同溫度梯度結(jié)果，泳道1~8分別為65℃、64.3℃、63℃、61.1℃、58.8℃、56.9℃、55.7℃、55℃。圖C為經(jīng)過整夜活化后的單克隆所提取質(zhì)粒，在經(jīng)過XhoI和BamHI雙酶處理后的切割結(jié)果。Cry2A-like表達分析經(jīng)過驗證實驗的確認，克隆子已被成功導入BL21(DE3)表達菌株中。之后，我們從轉(zhuǎn)化后的菌落中隨機選擇了單個菌落進行PCR檢測，確保其活化成功。緊接著，我們在兩種不同的溫度環(huán)境（16℃與28℃）下，分別采用0.05mM和1mM的IPTG濃度對菌落進行了誘導表達。誘導表達結(jié)束后，我們收集了在不同實驗條件下的細菌樣本，并用PBS緩沖液對其進行了洗滌。然后，我們運用超聲波技術(shù)對細菌進行了細胞破碎，整個破碎過程持續(xù)10分鐘，期間采用每破碎5秒后暫停5秒的方式循環(huán)進行。破碎工作完成后，通過12000rpm離心30分鐘，成功分離了上清液與沉淀。對上清液和沉淀進行了備樣處理，加入5×SDSLoadingBuffer后充分混勻，并在沸水中蒸煮5分鐘。再次以12000rpm離心10分鐘后，進行了SDS電泳分析，以確定最佳的表達條件。實驗結(jié)果顯示，在16℃、0.05mMIPTG條件下，成功表達出了大量可溶性蛋白，其中編碼完整基因的表達產(chǎn)物分子量約為71.3kDa。圖3.2Cry2A-like各條件下表達SDS電泳圖示注：M:三色預(yù)染蛋白Marker;泳道1為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導上清；泳道2為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導沉淀；泳道3-4：分別為0.05mMIPTG在16℃、20h上清液及沉淀；泳道5-6：分別0.1mMIPTG在16℃、20h上清液及沉淀；泳道7-8：分別為0.05mMIPTG在28℃、20h上清液及沉淀；泳道9-10：分別為0.1mMIPTG在28℃、20h上清液及沉淀。Cry2A嵌合毒素的設(shè)計與克隆Cry2A嵌合毒素的設(shè)計Cry2A-like為實驗室自主分離鑒定的一個新型毒素蛋白，但經(jīng)生物活性測定，該毒素對小菜蛾和棉鈴蟲的殺蟲活性并不顯著。提高毒素效力以阻止或延緩昆蟲抗性。在研究的過程中發(fā)現(xiàn)，Cry2A-like與Cry2Ab的N端結(jié)構(gòu)域相同，但M端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域差別很大。因此，本研究采用置換M端結(jié)構(gòu)域策略來增強殺蟲蛋白對昆蟲的毒素效力，獲取Cry2A-like與Cry2Ab的三個結(jié)構(gòu)域的目的片段，通過無縫克隆交換結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了兩種嵌合蛋白Cry2A-1和Cry2A-2。圖3.3Cry2Ab和Cry2A-like毒素蛋白結(jié)構(gòu)域進行置換Cry2A嵌合毒素的克隆為滿足無縫克隆的技術(shù)要求，我們精心設(shè)計了合適的引物并成功合成。以提取的總DNA作為PCR擴增的模板，我們成功擴增得到了Cry2Ab和Cry2A-like基因的目標DNA片段。同時，我們也從表達載體pET-3中順利提取了質(zhì)粒，并通過雙酶切技術(shù)獲得了線性化的載體。隨后，我們將線性化的pET-28a載體與Cry2Ab及Cry2A-like基因片段分別進行了無縫克隆連接，并成功地將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入了BL21(DE3)菌株中。為了確認陽性克隆子的構(gòu)建是否正確，我們綜合運用了PCR、酶切分析以及DNA測序等多種方法進行驗證。實驗結(jié)果如圖展示，清晰地證明了Cry2Ab和Cry2A-like目標片段的成功擴增。更進一步的驗證，包括表達子PCR、酶切分析以及測序結(jié)果，均顯示實驗數(shù)據(jù)與預(yù)期相符，且未發(fā)現(xiàn)任何特異性突變。因此，可以確信已經(jīng)成功地構(gòu)建了Cry2Ab和Cry2A-likeBL21(DE3)表達工程菌株，為后續(xù)研究奠定了堅實基礎(chǔ)。圖3.4Cry2Ab和Cry2A-like目的片段PCR注：M:三色預(yù)染蛋白Marker;泳道1~6分別為2A1-1、2A1-2、2A1-3、2A2-1、2A2-2、2A2-3片段Cry2A嵌合毒素的表達分析和生測Cry2A嵌合毒素的表達分析經(jīng)過精心設(shè)計與構(gòu)建，嵌合基因已成功導入大腸桿菌BL21(DE3)細胞內(nèi)。為了進一步優(yōu)化蛋白表達條件，進行了一系列實驗，涵蓋了不同溫度、IPTG濃度和誘導時間等多個變量。經(jīng)過嚴謹?shù)膶嶒烌炞C，成功實現(xiàn)了Cry2A-1和Cry2A-2嵌合基因的異源表達。通過詳細的比對分析，發(fā)現(xiàn)當溫度為16℃、IPTG濃度為0.1mM、誘導培養(yǎng)時間為20h時，蛋白表達效果達到最佳狀態(tài)。低濃度的IPTG能夠有效調(diào)節(jié)蛋白表達速度，有助于蛋白質(zhì)的準確折疊，進而減少包涵體蛋白質(zhì)的形成，提升重組蛋白的可溶性表達REF_Ref25241\r\h[17]。圖3.5Cry2A-1和Cry2A-2雙酶切驗證、表達SDS電泳圖示注：M:三色預(yù)染蛋白Marker;左圖泳道依次分別為Cry2A-1和Cry2A-2雙酶切驗證圖；右圖為Cry2A-1和Cry2A-2在0.1mMIPTG在16℃誘導表達20h條件下表達SDS電泳圖；泳道1為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導上清；泳道2為pET-28a空載轉(zhuǎn)入BL21(DE3)0.5mMIPTG誘導沉淀；泳道3：Cry2A-1上清液；泳道4：Cry2A-1沉淀；泳道5：Cry2A-2上清液；Cry2A-2沉淀Cry2A嵌合毒素生物活性的測定除此之外，為了進一步評估可溶性毒素蛋白Cry2A-like的生物活性，還對棉鈴蟲和小菜蛾進行了定性的生物活性測定，將成功表達的嵌合蛋白進行室內(nèi)殺蟲活性測定。經(jīng)過定性實驗，記錄從第1天至第7天的昆蟲死亡數(shù)量。對于所收集的生測數(shù)據(jù)，采用了GraphPadprism7軟件進行了深入的分析。根據(jù)測試結(jié)果，Cry2A-1與Cry2A-2對于所測試小菜蛾幼蟲展現(xiàn)出明顯的殺蟲活性，然而未對棉鈴蟲展現(xiàn)出明顯的殺蟲活性。但是經(jīng)過嵌合改造后，Cry2A-1、Cry2A-2明顯均對所測試棉鈴蟲、小菜蛾幼蟲的殺蟲毒性效力增高。圖3.5生物活性測定討論經(jīng)深入探究，Cry2類毒素作為Bt殺蟲毒素，具備高序列相似性，但在殺蟲特異性和殺蟲譜方面存在顯著差異。特別值得一提的是，部分Cry2類毒素對鱗翅目和雙翅目幼蟲均展現(xiàn)雙重活性。據(jù)競爭結(jié)合實驗結(jié)果顯示，Cry2類蛋白與廣泛運用于防治鱗翅目害蟲的Cry1A、Vip3A蛋白在棉鈴蟲中腸并不競爭結(jié)合位點，這意味著它們之間不存在交互抗性。因此，Cry2類蛋白被視為昆蟲抗性治理的重要候選蛋白。為了更全面地理解Cry2A類殺蟲蛋白的作用機制，我們進行了系統(tǒng)的文獻回顧和實驗研究。經(jīng)過對比分析不同Cry2A類殺蟲蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，我們發(fā)現(xiàn)其殺蟲活性與某些特定結(jié)構(gòu)域緊密相連。基于此，通過結(jié)構(gòu)域交換和嵌合改造Cry2A-like，有望開發(fā)出具有更高殺蟲活性的新型生物殺蟲劑。然而，目前關(guān)于Cry2A類殺蟲蛋白的研究報道尚顯不足，這在一定程度上限制了其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。本研究致力于通過結(jié)構(gòu)域交換和修飾，對Cry2A殺蟲蛋白進行深入研究，旨在解決現(xiàn)有問題，提高其對特定靶標昆蟲的毒性效力。經(jīng)過結(jié)構(gòu)域交換，我們成功地將Cry2A殺蟲蛋白的關(guān)鍵功能區(qū)域與其